骆驼蓬种子中一种具抗肿瘤活性蛋白的分离纯化及鉴定

骆驼蓬种子经浸提、硫酸铵沉淀、CM阳离子交换层析和Superdex 75凝胶过滤层析分离纯化得到一种具有抗肿瘤细胞增殖活性的蛋白(命名为PhLTP),经Tricine-SDS-PAGE检测为单一蛋白条带,高效液相色谱检测其表观分子量为14.8 kDa左右,表明PhLTP是由两条相同的亚基组成的蛋白。采用Edman降解法对该纯化蛋白的N-末端进行氨基酸测序,其N-末端序列与其他植物非特异性脂转移蛋白相似。对PhLTP抗肿瘤活性进行研究,结果表明其对HeLa、Eca-109、MGC-9和BEL-7404细胞都有增殖抑制活性,其中对HeLa细胞增殖的抑制作用较好,并具有浓度和时间依赖性,其IC50为45μg/mL。通过Hoechst33258染色观察细胞形态,发现PhLTP能诱导HeLa细胞发生凋亡。

重组骆驼蓬脂转移蛋白与顺铂联合抑制黑色素瘤B16细胞增殖效应的研究

旨在探讨重组骆驼蓬脂转移蛋白(Recombinant Peganum harmala lipid transfer protein,r Ph LTP)与顺铂(DDP)联用对鼠黑色素瘤B16细胞增殖抑制和凋亡诱导作用。MTT法检测r Ph LTP、顺铂单独及联用后对鼠黑色素瘤B16细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞凋亡,活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和线粒体膜电位(Δψm)的变化情况。结果显示,r Ph LTP和DDP联用后细胞生长抑制率和凋亡率显著高于DDP单独处理组(P<0.01);而且胞内ROS升高的水平均高于单独处理组(P<0.01),胞内Δψm水平均低于单独处理组,但无显著性差异。r Ph LTP可增强顺铂对B16细胞的生长抑制并促进细胞凋亡,与顺铂具有协同作用。

重组骆驼蓬脂转移蛋白对B16实体瘤的抑制作用

目的:研究重组骆驼蓬脂转移蛋白(Peganum harmala lipid transfer protein,rPhLTP)对鼠黑色素瘤(B16)的体内抑制作用。方法:取B16细胞接种于C57BL/6J小鼠皮下,随机分为5组。测量各组瘤体积并称瘤重,计算抑瘤率。光镜观察脾脏、肝脏等变化;采用免疫组织化学法检测各肿瘤组织中血管内皮生长因子(VEGF)的表达。结果:高、中、低剂量处理组肿瘤相对体积(V/Vo)分别为3.21±0.12、3.57±0.07和3.92±0.42,抑瘤率分别为71.7%、58.1%和29.5%。显微镜下可见rPhLTP实验组肿瘤组织的细胞有不同程度的点、片状坏死。而肝、肺等无明显病理损伤。高剂量组中VEGF阳性表达指数低于生理盐水组(P<0.01),rPhLTP能明显抑制肿瘤血管的生成。结论:rPhLTP能有效地抑制小鼠B16细胞实体瘤的生长,其抗肿瘤的机制可能是通过抑制血管的生成来抑制肿瘤的生长。

骆驼蓬脂转移蛋白基因真核表达载体的构建及其体内外抗瘤效应的研究

目的:构建骆驼蓬脂转移蛋白(lipid transfer protein from Peganum harmala,PhLTP)基因真核表达质粒,并探讨其对黑色素瘤B16细胞在体内外的抗肿瘤作用。方法:将PhLTP基因亚克隆至pcDNA3.1上,获得重组质粒pcDNA3.1-PhLTP;用脂质体转染法将重组质粒及空载体外转染B16细胞,MTT检测其对B16细胞生长的影响。建立B16荷瘤小鼠模型,设重组质粒(pcDNA3.1-PhLTP)、空载(pcDNA3.1)、生理盐水和阳性药物(CTX)组,分别处理小鼠后测量各组肿瘤体积并称瘤重,计算抑瘤率。光镜观察鼠脾、肝等组织变化;免疫组织化学法检测各瘤体中PhLTP、血管内皮生长因子(VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达。结果:pcDNA3.1-PhLTP转染B16细胞72 h后,细胞增殖能力明显受到抑制(P<0.01)。注射pcDNA3.1-PhLTP组的小鼠肿瘤生长速度明显减慢,肿瘤体积小于空载和生理盐水组(P<0.05)。显微镜下可见重组质粒组肿瘤细胞有不同程度的点、片状坏死,而肝、肺等无明显病理损伤。重组质粒组肿瘤组织中有PhLTP蛋白的表达,且VEGF和bFGF的阳性表达指数都低于空载和生理盐水组(P<0.01)。结论:成功构建了重组表达质粒pcDNA3.1-PhLTP,体内外实验结果显示其能有效地抑制B16细胞的生长,预示了该重组质粒在治疗黑色素瘤中的潜在应用价值。

骆驼蓬脂转移蛋白基因克隆、表达及体外抗癌活性分析

[目的]构建骆驼蓬脂转移蛋白(Ph LTP)原核表达载体,并研究表达产物的体外抗癌活性。[方法]采用RT-PCR法从骆驼蓬(Peganum harmala)叶中扩增Ph LTP基因,将其成熟肽片段克隆至p ET-30a载体上,构建表达载体p ET-30a-Ph LTP,将重组质粒转化E.coli BL21进行原核表达,通过镍柱纯化获得重组骆驼蓬脂转移蛋白(r Ph LTP),经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定,用MTT法检测其体外抗癌活性。[结果]成功构建骆驼蓬脂转移蛋白c DNA表达载体p ET-30a-Ph LTP,其在E.coli中以可溶性融合蛋白形式表达,分子量约为18 k Da。经镍柱纯化后重组蛋白r Ph LTP能够显著抑制宫颈癌He La、黑色素瘤B16和食管癌Eca-109细胞的生长,IC50值分别为16.76±1.23、38.92±2.16和9.01±1.01μg/m L。[结论]克隆了骆驼蓬脂转移蛋白基因并在原核表达系统中成功表达,r Ph LTP所显示的显著抗癌活性预示其具有临床应用的潜能。

重组骆驼蓬脂转移蛋白对宫颈癌HeLa细胞化疗的增敏作用

[目的]研究重组骆驼蓬脂转移蛋白(recombinant Peganum harmala lipid transfer protein,r Ph LTP)与顺铂(DDP)协同对宫颈癌He La细胞的抑制作用及可能的作用机制。[方法]四甲基偶氮咗蓝(MTT)法检测He La细胞生长的抑制率;Annexin-V/PI双染法检测细胞凋亡率,流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)的变化情况。[结果]r Ph LTP与DDP联合应用后与相应的DDP组相比,对细胞生长的抑制率显著增强(P<0.01),低浓度r Ph LTP联合2.5μg/m L顺铂对He La细胞的抑制率为(42.50±0.059)%,远高于高浓度顺铂(10μg/m L)对He La细胞的抑制率(36.88±0.134)%,细胞的凋亡率显著增加(P<0.01),细胞内ROS极明显升高(P<0.001)。[结论]r Ph LTP能够显著增强顺铂对He La细胞的化疗敏感性(P<0.001),这种作用可能与r Ph LTP增强顺铂诱导细胞内活性氧的产生导致细胞凋亡有关。