日本血吸虫重组质粒pET32α-Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的构建日本血吸虫重组质粒pET32_α-Sj32,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增Sj32抗原编码基因,克隆至原核表达载体pET32_α(+),构建重组质粒pET32_α-Sj32,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。结果 RT-PCR扩增出1270bp的Sj32基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj32基因成功插入pET32_α中,SDS-PAGE分析显示表达产物为分子质量单位约为55 ku的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的23%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别。结论成功构建了日本血吸虫重组质粒pET32_α-Sj32,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性。

日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的构建日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj32,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增Sj32抗原编码基因;将该基因克隆至原核表达载体pET28α,构建重组质粒pET28α-Sj32并转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。结果RT-PCR扩增出1270bp的Sj32基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj32基因成功插入pET28α中,SDS-PAGE分析显示表达产物为分子质量单位约为42ku的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的24%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别。结论成功构建了日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj32,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有抗原特异性。

日本血吸虫重组质粒pET28α—Sj26GST—Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达

目的构建日本血吸虫重组质粒pET28α－Sj26GST—Sj32，观察该质粒在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达。方法超声粉碎日本血吸虫成虫，提取总RNA，通过RT—PCR扩增获得Sj26GST和Si32抗原编码基因，然后采用基因拼接法剪接Sj26GST和Sj32，得到Sj26GST—Sj32融合基因，克隆至大肠埃希菌原核表达载体pET28α，构建重组质粒pET28α-Sj26GST—Sj32，转化大肠埃希菌BL21（DE3），经异丙基硫代-β—D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达后用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）和Western印迹法对表达产物进行分析和鉴定。结果基因拼接法扩增出长度约1991bp的Sj26GST—Sj32融合基因；双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST—Sj32融合基因成功插入pET28α中，SDS—PAGE分析显示表达产物为相对分子质量约69×10^3的重组蛋白．与预期结果一致，表达的蛋白约占菌体总蛋白的25％；Western印迹法鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别。结论成功构建了日本血吸虫重组质粒pET28α—Sj26GST—Sj32，该质粒在大肠埃希菌BL21（DE3）中获得了高效融合表达，表达的融合蛋白具有特异的抗原性。

卡介苗D2株分泌蛋白基因植物表达载体的构建

目的 克隆卡介苗 (BCG)D2株 32 -kDa分泌蛋白基因 (fbpA基因 ) ,构建重组植物表达载体 pBI12 1-fbpA ,为研制转基因植物口服疫苗奠定基础。 方法 采用PCR法从BCGD2株基因组DNA中分离fbpA基因 ,构建重组克隆载体 pUCm -T -fbpA ,经过单菌落PCR法、BamHⅠ、SacⅠ和HindⅢ单 /双酶切、DNA序列分析鉴定后 ,将fb pA基因亚克隆入植物表达载体 pBI 12 1,得到重组载体pBI 12 1-fbpA ,并转化根癌农杆菌株EHA10 5 ,用PCR法对其进行鉴定。结果 重组载体 pUCm -T -fbpA测序后证实fbpA基因由 10 4 1bp组成 ,包括 1个 10 14bp的开放阅读框。DNA序列上游由编码一段信号肽的 12 9bp组成 ,并对 32 -kDa蛋白的分泌起决定作用。相应的编码成熟蛋白的序列由 885个碱基组成。fbpA基因与来源于BCG1173P2株的同一基因序列完全一致。此外 ,构建的重组植物表达载体 pBI12 1-fbpA成功转入根癌农杆菌株EHA10 5。结论 编码BCGD2株 32 -kDa分泌蛋白的fbpA基因分离成功 ,DNA序列分析证实fbpA基因在分枝杆菌中高度保守 ,为进一步深入分析fbpA基因以及研制抗结核病转基因植物疫苗奠定了基础。

日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶重组质粒的构建及其在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达

目的 构建日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶（Sj26GST）重组质粒pET32α-Sj26GST,观察该质粒在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达.方法 超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增Sj26GST抗原编码基因,克隆至原核表达载体pET32α（＋）,构建pET32α-Sj26GST,转化大肠埃希菌BL21（DE3）,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达后,用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western blot 对表达产物进行分析和鉴定.结果 RT-PCR扩增出676 bp的Sj26GST基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST基因成功插入pET32α（＋）中,SDS-PAGE分析显示表达产物为相对分子质量约为49×10^3的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的24%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别.结论 成功构建了pET32α-Sj26GST,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性.