血管基膜衍生多功能肽基因克隆、表达及空间构象分析

目的 :构建血管基膜衍生多功能肽克隆和原核表达载体 ,并对血管基膜衍生多功能肽氨基酸序列进行空间结构分析预测。方法 :用人源性IgG3上游铰链区连接肽连接的Tumstatin的 2个功能区片段 ,即血管基膜衍生多功能肽 (VB MDMP) ,利用合成的 3条长引物片段 ,进行PCR扩增。克隆到 pUC19载体 ,酶切和测序鉴定。亚克隆构建原核表达载体pGEX 4T 1 VBMDMP ,IPTG诱导表达 ,聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表达产物。用GlutathioneSepharose 4B层析柱进行了亲和层析鉴定。将VBMDMP序列输入计算机 ,利用Antheprot软件分析。 结果 :血管基膜衍生多功能肽 (VBMDMP)基因经限制性内切酶酶切和测序鉴定 ,其大小和核苷酸序列正确 ,与设计完全一致。获得了原核表达融合蛋白GST VBMDMP。Anthep rot分析显示 ,人IgG3上游铰链区连接后的Tumstatin的 2个功能区域能自由伸展。 结论 :成功构建了血管基膜衍生多功能肽克隆和原核表达载体 ,并对其进行了空间结构分析。

血管基膜衍生多功能肽在大肠杆菌中的表达及抗肿瘤活性的测定

目的 构建血管基膜衍生多功能肽(VBMDMP)原核表达载体、诱导表达GST-VBMDMP融合蛋白,观察其对Lewis肺癌自发转移瘤模型的影响。方法 人工合成VB-MDMP DNA序列(人源性IgG3上游铰链区连接肽连接的Tumstatin的两个功能区获得性肽基因序列),构建克隆载体PUC19-VBMDMP,亚克隆到pGEX-4T-1原核表达载体上,经测序和酶切分析鉴定获得了未发生移码突变的PGEX-4T-1-VBMDMP融合载体质粒。转化入大肠杆菌后,用 IPTG诱导表达融合蛋白。Glutathione sepharose 4B层析柱纯化蛋白表达产物。采用Lewis肺癌自发转移瘤模型,检测VBMDMP的抗肿瘤作用。结果 成功的构建pUC19-VB-MDMP克隆和pGEX-4T-1-VBMDMP表达载体,在大肠杆菌获得稳定表达,用Glutathione sepharose 4B层析柱获得纯化的GST-VBMDMP融合蛋白。VBMDMP(GST-VBM-DMP 10、6、2 mg·kg^(-1))对小鼠Lewis肺癌原发瘤具有抑制作用(瘤重抑制率分别为95.5％,80.4％,60.05％)。VBMDMP(GST-VBMDMP 10,6,2 mg·kg^(-1))对小鼠Lewis肺癌自发性肺转移具有抑制作用(自发性肺转移瘤结节抑制率分别为94.8％,86.4％,73.9％)。结论 VBM-DMP对小鼠Lewis肺癌原发瘤和肺转移具有抑制作用。

重组血管基膜衍生多功能肽对肺腺癌A549细胞信号蛋白磷酸化水平的影响

目的研究重组血管基膜衍生多功能肽(rVBMDMP)对人肺肺癌A549细胞信号蛋白磷酸化水平的影响,初步探索rVBMDMP抗肿瘤作用的分子机制。方法体外培养肺腺癌A549细胞,制备全细胞抽提液,采用信号转导抗体芯片检测rVBMDMP处理前后A549细胞信号蛋白磷酸化水平变化。结果 rVBMDM作用后磷酸化水平升高的包括黏着斑激酶FAK、细胞凋亡相关蛋白死亡受体(Fas)、死亡配体(FasL)、半胱胺酸蛋白酶蛋白(Caspase-6)、Fas相关因子1(FAF1)、和脆性组氨酸三联体蛋白(FHIT)等79个蛋白,下调的有整合蛋白αv、β1和β3、细胞凋亡相关蛋白Bcl-2及核转录调节因子NF-κB等30个蛋白。结论 rVBMDMP抗肿瘤作用的分子机制可能与激活整合蛋白受体途径和死亡受体途径,以及使Bcl-2蛋白发生去磷酸化有关。

血管基膜衍生多功能肽的表达及其生物活性的鉴定

目的：在毕赤酵母中表达血管基膜衍生多功能肽（vascular basement membrane—derived mulifunctional peptide，VB—MDMP），并鉴定其生物学活性。方法：利用PCR技术获得融合了谷胱甘肽转移酶（GST）的肿瘤抑素（tumstatin）活性成分的GST—VBMDMP基因，克隆到pPIC9K载体；然后原生质体转化法转化毕赤酵母细胞，行多克隆筛选和表型鉴定。获得His’Muts表型的转化子，在MGY培养液中30℃摇床培养，每24h从培养液中转移1ml培养液上清于-70℃保存，并保持培养瓶中培养液的量和培养液中甲醇0．5％的浓度不变，第9天行SDS—PAGE检测表达的蛋白并纯化，然后进行细胞和动物生物活性检测。结果：SDS—PAGE发现阳性重组子在MGY培养液中表达的蛋白量在1～7d逐渐增加，到第8天后开始减少，用Gluta—thioneSepharose4B亲和层析柱纯化获得GST—VBMDMP融合蛋白；GST—VBMDMP能抑制C57BL／6鼠动脉内皮细胞管状结构的形成；同时GST—VBMDMP（2、6、10mg／kg）对小鼠Lewis肺癌原发瘤（瘤重抑制率分别为96．6％、82．1％、61．2％）和自发性肺转移瘤（瘤结节抑制率分别为96．8％、87．9％、75、3％）均具有明显的抑制作用（P〈0.01）。结论：VBMDMP能够抑制鼠动脉内皮细胞管状结构的形成，并对小鼠Lewis肺癌原发瘤和肺转移具有明显的抑制作用。

血管基膜衍生多功能肽抗人结肠癌作用研究

目的 研究重组血管基膜衍生多功能肽（vascular basementme mbranederived muldfunction pepude，VBMDMP）的抗人结肠癌作用。方法 体外培养人结肠癌细胞系（SW480）细胞和中国仓鼠卵巢细胞系（CHO-K1）细胞。采用MTT比色法检测重组VBMDMP对SW480细胞选择性抑制增殖作用；胎盼蓝染色细胞计数法检测重组VBMDMP对SW480细胞和CHO-K1细胞生长曲线的影响；人结肠癌（SW480）细胞裸鼠异种移植瘤模型治疗实验观测重组VBMDMP体内抗人结肠癌作用。结果 重组血管基膜衍生多功能肽具有选择性抑制体外培养人结肠癌细胞系SW480细胞增殖和生长作用，呈剂量依赖性。而对CHO-K1细胞的增殖活性影响小。重组血管基膜衍生多功能肽对SW480细胞裸鼠异种移植瘤生长具有显著抑制作用．呈剂量依赖性。1、5、10mg／kg重组VBMDMP的肿瘤生长抑制率分别为：63％，79％和83％；瘤重抑制率分别为：62％、66％和75％。10mg/4kg重组VBMDMP的肿瘤生长抑制率和瘤重抑制率均接近100mg／kg环磷酰胺（CTX），高于20ms／kg 血管生成抑制剂烟曲霉素衍生物TNP-470。结论 重组血管基膜衍生多功能肽对人结肠癌细胞增殖和生长具有显著抑制作用。

血管基膜衍生多功能肽抑制肺癌裸鼠移植瘤生长和血管生成

目的:研究重组血管基膜衍生多功能肽(rVBMDMP)对人肺癌裸鼠移植瘤生长和血管生成的抑制作用。方法:人肺癌A549裸鼠移植瘤模型治疗实验,评价rVBMDMP治疗人肺癌的有效性;CD34免疫组化染色检测rVB-MDMP对移植瘤血管生成的影响。结果:rVBMDMP显著抑制人肺癌裸鼠移植瘤的生长,呈剂量依赖性趋势。与模型组相比,5 mg/kg rVBMDMP对人肺癌裸鼠移植瘤的肿瘤生长抑制率是74%;CD34免疫组化染色结果表明5 mg/kgrVBMDMP组微血管密度为(38.56±4.64),显著低于模型组(91.82±6.48)。结论:rVBMDMP对人肺癌裸鼠移植瘤生长和血管生成具有抑制作用。

重组血管基膜衍生多功能肽抗血管新生活性的研究

目的:观察重组血管基膜衍生多功能肽(rVBMDMP)抗血管新生的活性。方法:采用MTT法检测rVB-MDMP对血管内皮细胞增殖活性的影响,台盼蓝染色细胞计数法测定其对血管内皮细胞生长的影响,内皮管结构形成实验测定其对血管内皮细胞内皮管结构形成能力的影响,PI染色流式细胞分析术检测其对血管内皮细胞凋亡率的影响,吖啶橙染色荧光显微镜观察rVBMDMP作用后细胞凋亡形态学的改变,划痕法测定其对血管内皮细胞迁移能力的影响。结果:MTT法、台盼蓝染色细胞计数法显示rVBMDMP能显著抑制血管内皮细胞增殖和生长,其作用呈剂量和时间依赖性,1.0μmol/L rVBMDMP作用96 h时,血管内皮细胞的活细胞数仅为溶酶对照组的50%。内皮管结构形成实验结果表明,rVBMDMP能显著降低血管内皮细胞的内皮管状结构数目(17.67±3.055与50.33±3.055)。流式细胞术结果显示,rVBMDMP处理后细胞凋亡率呈浓度依赖性增加,其中1.0μmol/L浓度组凋亡率高达14.41%。吖啶橙染色荧光显微镜下观察细胞出现典型凋亡的形态学改变。划痕法显示rVBMDMP对细胞迁移能力无明显影响。结论:rVBMDMP具有显著的抗血管新生活性。

血管基膜衍生多功能肽选择性抑制人肺癌细胞增殖

目的:观察重组血管基膜衍生多功能肽(Vascular basement membrane derived multifunctional peptide,VBM-DMP)对人肺癌细胞增殖的选择性抑制作用。方法:体外培养人肺癌(A549)细胞、人胚肺二倍体成纤维细胞(KMB-17),采用MTT比色法测定重组VBMDMP对A549细胞增殖的选择性抑制作用;台盼蓝染色细胞计数法观察重组VBMDMP对A549细胞和KMB-17细胞生长曲线的影响;采用人肺癌(A549)细胞裸鼠异种移植瘤模型治疗实验,评价重组VBMDMP治疗人肺癌的有效性。结果:体外实验结果表明重组VBMDMP能选择性抑制人肺癌(A549)细胞的增殖和生长,呈剂量依赖性,而对KMB-17细胞的增殖活性影响小;重组VBMDMP显著抑制人肺癌(A549)细胞裸鼠异种移植瘤的生长,呈剂量依赖性趋势。1 mg/kg和5 mg/kg重组VBMDMP的肿瘤生长抑制率分别是42%和74%,瘤重抑制率分别42%和77%,其中5mg/kg重组VBMDMP的肿瘤生长抑制率和瘤重抑制率均高于环磷酰胺(CTX100 mg/kg)、血管生成抑制剂烟曲霉素衍生物TNP-470(20 mg/kg)。结论:重组VBMDMP对人肺癌细胞(A549)的增殖和生长具有显著抑制作用,是一种选择性高,抗肿瘤作用强的新型抗肿瘤基因工程候选药物。

血管基膜衍生多功能肽抗人结肠癌作用研究

目的:研究重组血管基膜衍生多功能肽VBMDMP的抗人结肠癌作用。方法:体外培养人结肠癌细胞系(SW480)细胞和中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-K1)细胞,采用MTT比色法检测重组VBMDMP对SW480细胞选择性抑制增殖作用;胎盼蓝染色细胞计数法检测重组VBMDMP对SW480细胞和CHO-K1细胞生长曲线的影响;人结肠癌(SW480)细胞裸鼠异种移植瘤模型治疗实验观测重组VBMDMP体内抗人结肠癌作用。结果:重组血管基膜衍生多功能肽具有选择性抑制体外培养人结肠癌细胞系SW480细胞增殖和生长作用,呈剂量依赖性。而对CHO-K1细胞的增殖活性影响小。重组血管基膜衍生多功能肽对SW480细胞裸鼠异种移植瘤生长具有显著抑制作用,呈剂量依赖性。1 mg/kg、5 mg/kg和10 mg/kg重组VBMDMP的肿瘤生长抑制率分别为:63%,79%和83%;瘤重抑制率分别为:62%,66%和75%。其中10 mg/kg重组VBMDMP的肿瘤生长抑制率和瘤重抑制率均接近100 mg/kg环磷酰胺(CTX),高于20 mg/kg血管生成抑制剂烟曲霉素衍生物TNP-470。结论:重组血管基膜衍生多功能肽对人结肠癌细胞增殖和生长具有显著抑制作用。

重组血管基膜衍生多功能肽抑制人肝癌HepG2裸鼠移植瘤生长和血管生成

目的:研究重组血管基膜衍生多功能肽rVBMDMP对人肝癌HepG2裸鼠移植瘤生长和血管生成的抑制作用。方法:体外培养人肝癌HepG2细胞和人胚肝L-02细胞,MTT法测定不同浓度的rVBMDMP对HepG2细胞的选择性抑制增殖作用;人肝癌HepG2裸鼠移植瘤模型治疗实验评价rVBMDMP体内抗人肝癌作用;CD31免疫组化方法分析rVBMDMP处理的HepG2裸鼠移植瘤组织微血管面积(MVA)的比例。结果:rVBMDMP具有选择性抑制体外培养人肝癌HepG2细胞增殖作用,呈剂量依赖性,而对L-02细胞的增殖活性无明显的影响。rVBMDMP对HepG2裸鼠移植瘤生长具有显著抑制作用,呈剂量依赖性。1.0 mg/kg、3.0 mg/kg和10.0 mg/kg的rVBMDMP的肿瘤生长抑制率分别为:12.4%,55.8%和79.7%。其中10.0 mg/kg的rVBMDMP的肿瘤生长抑制率近似于20.0 mg/kg的5-氟尿嘧啶(5-FU,80.1%)。rVBMDMP处理的人肝癌HepG2裸鼠移植瘤组织的CD31染色阳性区域面积百分比随着rVBMDMP浓度的增加明显降低。结论:rVBMDMP对人肝癌HepG2细胞增殖和裸鼠移植瘤生长具有显著抑制作用,同时具有抗肿瘤血管生成效应。

血管基膜衍生多功能肽基因在毕赤酵母中的表达和活性鉴定

目的:利用PCR技术从含有目的基因的质粒pGEX- 4T- 1 -VBMDMP获得带有SnabI和NotI酶切位点并融合有GST的目的基因片段并测序鉴定,将PCR产物纯化、酶切、回收,克隆到pPIC9K载体,转化入大肠杆菌DH5a扩增,用琼脂糖凝胶电泳,限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定。方法:BglⅡ线性新构建的表达载体pPIC9K- GST- VBMDMP ,然后用原生质体转化法转化毕赤酵母细胞,并用pPIC9K空质粒也转入酵母细胞进行对照。用煮 冻 煮法裂解已转化有目的基因的毕赤酵母细胞提取DNA并行PCR鉴定,获得阳性重组子,行多克隆筛选和表型鉴定。筛选His+ Muts 表型的转化子,在MGY液体培养基中30℃摇床培养,每2 4h从培养基中转移1ml培养基上清于- 70℃保存,并保持培养瓶中培养基的量和培养基中甲醇0 .5 %的浓度不变,8d后行SDS -PAGE检测表达的蛋白,用GlutathioneSepharose 4B亲和层析柱纯化获得GST- VBMDMP融合蛋白;用凝血酶切割GST- VBMDMP并分离获得VB MDMP。结果:发现VBMDMP能够抑制鼠主动脉内皮细胞管状结构的形成;同时(VBMDMP 10mg/kg ,6mg/kg ,2mg/kg)对小鼠Lewis肺癌原发瘤具有显著抑制作用(瘤重抑制率分别为96 .6 % ,82 .1% ,6 1.2 % )。VBMDMP(GST -VB- MDMP 10mg/kg ,6mg/kg ,2mg/kg)对小鼠Lewis肺癌自发性肺转移具有显著抑制作用(自发?