Research progress and prospects of nucleic acid isothermal amplification technology

Nucleic acid(DNA and RNA)detection and quantification methods play vital roles in molecular biology.With the development of molecular biology,isothermal amplification of DNA/RNA,as a new molecular biology technology,can be amplified under isothermal condition,it has the advantages of high sensitivity,high specificity,and high efficiency,and has been applied in various fields of biotechnology,including disease diagnosis,pathogen detection,food hygiene and safety detection and so on.This paper introduces the progress of isothermal amplification technology,including rolling circle amplification(RCA),nucleic acid sequence-dependent amplification(NASBA),strand displacement amplification(SDA),loop-mediated isothermal amplification(LAMP),helicase-dependent amplification(HDA),recombinase polymerase amplification(RPA),cross-priming amplification(CPA),and its principle,advantages and disadvantages,and application development are briefly summarized.

肉制品中马源性成分重组酶介导链置换等温扩增实时检测方法的建立及应用

目的:建立一种快速鉴定肉及肉制品中马源性成分的重组酶介导链置换等温扩增实时检测方法。方法:以马源性ATpase 6基因为靶基因设计多组特异性引物和Exo探针,通过引物筛选及反应参数优化,建立一种采用重组酶介导链置换等温扩增技术检测马源性成分的方法,并对该方法进行特异性、灵敏度和稳定性验证,同时通过对不同掺入比例混合样品、不同加工工艺模拟样品和市售样品进行检测,分析方法的检出限、适用性和准确性。结果:该方法反应迅速、特异性强、灵敏度高。可在39℃恒温条件下16min内完成反应;对23种非目标源性具有良好特异性;目标DNA的检测灵敏度可达到1.8copies/μL水平;对生肉的检出限为0.01%(质量分数,下同),对熟肉制品的检出限为0.1%;对90份市售样品进行检测,结果与标准方法一致。结论:建立的重组酶介导链置换等温扩增方法可用于肉及肉制品中马源性成分的掺假鉴别检测。

重组酶扩增技术概述及应用研究进展

重组酶扩增技术是近几年快速发展起来的一类等温扩增技术,相对于传统的核酸检测方法,具有设备要求低、操作简单等优势,在现场快速检测方面有着广阔的应用前景。本文简要介绍了重组酶扩增技术的技术原理、优点和难点,重点阐述了其在病毒、细菌、寄生虫及其他微生物检测领域的应用研究进展,旨在为重组酶扩增技术的进一步发展与应用提供参考。

鲤春病毒血症病毒RT-RAA-LFD检测方法的建立

为建立一种可现场快速准确检测鲤春病毒血症病毒(SVCV)的方法,本研究结合重组酶介导扩增(RAA)和侧向流试纸条(LFD)技术,根据SVCV L基因保守区域设计引物及探针,通过优化反应时间和温度等条件,初步建立了可用于SVCV现场可视化检测的RT-RAA-LFD方法。优化后的检测方法在35℃水浴锅中恒温反应15 min即可实现对SVCV目的基因片段的有效扩增。结果显示,该方法可以特异性的检测SVCV,并且不与病毒性出血败血症病毒、传染性鲑鱼贫血症病毒、病毒性神经坏死病毒等其他常见鱼类病毒发生交叉反应;对SVCV重组质粒标准品的检测限为2.42×10^(2)拷贝/μL,并具有较好的稳定性和重复性;采用该方法和病毒分离、套式RT-PCR、荧光定量RT-PCR、荧光定量RT-RAA共5种方法同时对45份临床样品检测,其中病毒分离、套式RT-PCR和荧光定量RT-PCR均检测到29份阳性样品,荧光定量RT-RAA和本研究建立的方法均检测到28份阳性样品,本研究与前3种方法的阳性符合率为97.8%,与荧光定量RT-RAA的阳性符合率为100%。上述结果表明,本研究建立的SVCV RT-RAA-LFD检测方法简便快捷、特异性强、敏感性高、结果可靠,且不依赖于复杂的仪器,可适用于现场和实验室对SVCV的快速检测。

重组酶介导扩增技术与传统聚合酶链反应技术在甲状腺癌DNA甲基化检测中的应用比较

目的建立重组酶介导的核酸扩增（RAA）技术特异性检测DNA甲基化的新方法并与传统的DNA甲基化特异性PCR（MSP）方法进行比较。方法选取OXTR基因作为目的基因，提取样品外周血基因组DNA，经亚硫酸氢盐修饰后分别以MSP和RAA技术进行特异性检测DNA甲基化实验。结果2种技术皆能扩增出OXTR非甲基化条带，而RAA技术成功扩增OXTR甲基化条带。结论RAA是一种新型的等温体外核酸扩增技术，实现了在37℃恒温下的核酸快速扩增，可成为替代MSP乃至其他PCR实验的新方法。

重组聚合酶扩增法在HIV-1 DNA检测中的初步应用

目的:明确重组聚合酶扩增法(RPA)对HIV-1 DNA检测的敏感性和特异性。方法:合成HIV-1 pol基因并克隆至pUC57载体,命名为pHIV-1-pol,作为RPA实验的阳性对照;以无RNA酶水作为阴性对照。对13例临床初诊患者进行RPR检测,并与HIV-1抗体检测结果进行验证比较。结果:RPA方法等温扩增20 min即可有效扩增目的片段,检测浓度最低可为101 copies/μL。三份HIV Ab(-)样本及阴性对照均未产生特异性扩增,阳性对照出现了特异性扩增。RPR检测阳性结果与HIV-1抗体检测结果完全一致,患者1、2、7、10、12检测为阳性。结论:RPA方法快速简单,特异性和敏感性高。

基于重组酶介导等温扩增技术的鸡滑液囊支原体检测方法建立和初步应用

为建立一种鸡滑液囊支原体(MS)快速简便的检测方法,研究根据MS vlhA基因保守序列设计3对引物,通过引物筛选和条件优化,建立了基于重组酶介导等温扩增技术(RAA)的MS检测方法,并对其特异性和灵敏度进行评估。应用该方法对68份鸡咽喉拭子临床样品进行检测,并和农业行业标准中的PCR方法进行对比。结果显示:该方法最佳引物为vlhA F3/vlhA R3,在38℃孵育25 min即可完成靶基因扩增,并且特异性强,与鸡毒支原体(MG)、禽多杀性巴氏杆菌、鸡沙门菌、鸡大肠杆菌、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒(AIBV)、鸡传染性法氏囊病病毒等其他鸡病病原体无交叉反应;灵敏度高,对MS基因组DNA的最低检出限度为15.5 pg;应用该方法从68份临床样品中检出阳性样品29份,与PCR方法检测结果一致。研究表明,建立的RAA方法快速简便,不依赖昂贵的仪器设备,有望用于基层实验室或MS的临床快速诊断。

非洲猪瘟病毒检测技术概述

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种具有急性、烈性、高度接触性的传染病,致死率高达100%,传播范围十分广泛,由于目前尚无有效的疫苗对这种病毒进行免疫预防,必须进行检测、扑杀和隔离,才能阻断病毒的传播,因此亟需建立简便、快速、有效的核酸检测方法。通过介绍当前使用的非洲猪瘟病毒的检测方法,归纳出各种方法的优缺点,并对非洲猪瘟病毒检测技术的发展方向进行阐述。

四种单增李斯特菌常用核酸检测方法的评价与应用

目的应用聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光PCR(Real-time PCR)、环介导等温扩增(LAMP)和多交叉置换扩增(MCDA)4种核酸检测方法,对单增李斯特菌进行检测,探索特异、灵敏、高效,且适用于肉类样本中单增李斯特菌检测的核酸检测方法。方法比较文献报道的以单增李斯特菌特异性基因lmo0733作为靶标的4种核酸检测方法,评价这4种方法在特异性、灵敏度、检出速率方面的差异,并应用于单增李斯特菌模拟样本和猪肉样本中单增李斯特菌的检测。结果传统PCR、Real-time PCR、LAMP和MCDA方法都能准确检测单增李斯特菌,其中MCDA方法检测下限为10 fg/反应,且能在30 min内完成对样本核酸的检测,灵敏度和检出速率优于其它3种核酸诊断方法;MCDA方法对于模拟样本和实际样本的检测效率优于其它3种核酸检测方法和传统分离培养方法,能够提高样本检测的阳性率。结论MCDA方法作为一种特异、灵敏和高效的核酸检测方法,可用于肉制品中单增李斯特菌检测时的快速筛查,并能提高传统分离培养方法对标本中单增李斯特菌的阳性检出率。

食源性致病菌核酸检测技术研究进展

近年来,食源性疾病的发病率逐年升高,已成为全球范围内的重大公共卫生问题。致病菌广泛存在于各种食品中,快速检测食源性致病菌,对提供安全的食物和预防食源性疾病具有重要的现实意义。由于传统食源性致病菌检测方法耗时耗力,因此建立食源性致病菌的快速检测技术尤为重要。食源性致病菌的核酸检测技术具有简便、耗时短、特异性强、灵敏度高等优点,已被广泛应用于食源性致病菌的检测。着重介绍近年来用于食源性致病菌检测的核酸检测技术,包括常规聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、多重聚合酶链式反应(multiplex-PCR,mPCR)、实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR,qPCR)、环介导等温扩增反应(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、聚合酶螺旋反应(polymerase spiral reaction,PSR)、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA),并对其优缺点,以及适用范围进行总结,旨在为开发出简单、快速、有效、准确的检测方法提供一定的理论依据。

等温核酸放大技术在重金属检测方面的应用

等温核酸放大技术是一种可以实现重金属污染物痕量分析的高灵敏性检测方法,在分析检测中有着广泛且重要的作用。本文综述了几种不同的等温核酸放大技术及其在重金属检测方面的应用,阐述分析了各方法的检测原理,为之后建立更加灵敏、快速、准确的检测方法提供了参考。虽然等温核酸放大技术目前主要停留在实验室阶段,并且检测目标有限,但是由于该技术的高灵敏性、特异性以及与其他学科紧密的联系性,具有潜在的应用前景。

猪瘟病毒实时荧光重组酶聚合酶扩增检测方法的建立及应用

[目的]建立猪瘟病毒(CSFV)快速、灵敏的检测方法。[方法]选择CSFV基因组中保守的5′端非编码区(NTR)作为研究对象,根据重组酶聚合酶扩增(RPA)原理,设计特异性RPA引物和exo探针,并对反应温度和时间进行优化,建立检测猪瘟病毒的实时荧光RPA方法。[结果]该研究建立的方法能在39℃恒温条件下30 min内得到检测结果,实现了快速检测CSFV的目的。该方法仅对CSFV的核酸有扩增反应,而对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)、副猪嗜血杆菌(HPS)、猪肺炎支原体(Mhp)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪水疱病病毒(SVDV)和猪细小病毒(PPV)8种常见猪病病原的检测结果均为阴性,表现出良好的特异性,对含有CSFV目的片段的重组质粒的最低检测限为8.3×10^(2)copies/μL。同时使用新建立的CSFV实时荧光RPA检测方法和国家标准(GB/T 16551—2020)中的实时荧光RT-PCR对采集自重庆某养猪场的33份临床样本进行CSFV核酸检测,以验证CSFV的实用性,结果显示,2种方法检出的阴、阳性样本完全一致。[结论]该研究建立的CSFV实时荧光RPA方法反应条件温和、核酸扩增迅速、检测结果特异、灵敏,为CSF的诊断提供了新的选择。

重组酶介导的扩增技术及活菌检测方法的应用研究进展

重组酶介导的扩增(recombinase-aid amplification,RAA)是一种新型等温体外核酸扩增方法,操作简单、反应效率高、灵敏度高。由于细菌死亡后其DNA在环境中可存在较长时间,利用RAA检测目标DNA片段极易产生假阳性结果,造成不必要的损失。因此,建立基于DNA扩增策略的活菌检测方法对食品加工、环境监测等多个领域具有重要意义。本文综述了RAA技术的原理及在病原微生物检测方面的应用,以及活菌检测技术的研究进展,以期为开发基于RAA技术的活菌检测方法提供理论指导。

体外核酸快速扩增技术的发展和不断创新

利用聚合酶链式反应(PCR)进行的核酸体外扩增是1983年开始发展起来的一项革命性技术,目前已被广泛运用于现代化的农业和医学以及食品工业等领域,特别是在人类认知基因和基因组的过程中,体外核酸扩增技术做出了卓越的贡献。最初,体外核酸扩增技术主要是利用耐高温的DNA聚合酶(Taq酶),这样就使核酸的体外扩增反应可以在热循环中进行。但因需要使用昂贵的设备和消耗大量的电力,其成本和应用范围都受到一定的限制。之后,恒温体外核酸扩增悄然兴起,这改变了传统扩增技术的局限性,使核酸的体外扩增更加简单和方便。重组酶介导扩增(RAA)法是一种最新型的恒温体外核酸扩增技术,该系统的显著优点在于它在常温下就能实现DNA解链并快速扩增(15～30min完成),反应快速、专一性好、灵敏度高,还可用于定时定量的结果分析。

基于荧光重组酶介导等温扩增技术的利什曼原虫核酸检测方法的建立

目的建立一种基于荧光重组酶介导等温扩增(recombinase-aided isothermal amplification,RAA)技术的检测利什曼原虫核酸的方法。方法针对利什曼原虫内转录间隔基因序列1(ITS1)基因设计用于RAA检测的特异性引物和探针,通过引物配对筛选、引物和探针浓度优化,建立检测利什曼原虫核酸的荧光RAA法。分别以构建的含利什曼原虫ITS1基因序列的不同拷贝数重组质粒和不同浓度利什曼原虫基因组DNA为模板进行RAA扩增,评估其检测灵敏度;以田鼠巴贝西虫、刚地弓形虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫等其他经输血传播的寄生虫基因组DNA为模板进行RAA扩增,评价其检测特异度。结果从9对引物组合中筛选出1对最佳引物对后,引物和探针终浓度经优化分别确定为0.3μmol/L和0.08μmol/L。所建立的荧光RAA法在39℃等温条件下20 min内可完成样本核酸检测。采用建立的RAA法对田鼠巴贝西虫、刚地弓形虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫等8种寄生虫基因组DNA进行检测,杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫基因组DNA在5 min内即出现明显荧光信号,与田鼠巴贝西虫、刚地弓形虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫无交叉反应。以含利什曼原虫ITS1基因序列的重组质粒为模板,荧光RAA法最低检测限为10拷贝/μL;以利什曼原虫基因组DNA为模板,荧光RAA法最低检测限为1 fg/μL。结论成功建立了一种基于荧光RAA法的利什曼原虫核酸检测技术,该方法反应快速、操作简便、灵敏度和特异度均较高,可用于利什曼原虫病流行区现场筛查。

重组酶介导的斯氏并殖吸虫等温扩增荧光检测方法的建立及检测效果初步评价

目的建立一种基于重组酶介导的等温扩增(recombinase-aided isothermal amplification, RAA)技术的斯氏并殖吸虫快速核酸检测方法,并对其检测效果进行初步评价。方法从溪蟹样本中分离出斯氏并殖吸虫、卫氏并殖吸虫和三平正并殖吸虫囊蚴,提取基因组DNA进行分子鉴定。以斯氏并殖吸虫线粒体细胞色素c氧化酶亚基I基因(cytochrome coxidase 1, cox1)基因序列作为靶序列设计、制备、筛选引物及探针。以河南省济源市和洛阳市宜阳县斯氏并殖吸虫囊蚴基因组DNA为模板进行荧光RAA检测方法验证。以含斯氏并殖吸虫cox1基因序列的不同浓度重组质粒和斯氏并殖吸虫囊蚴基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测灵敏度;应用建立的荧光RAA法同时检测卫氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫、华支睾吸虫和日本血吸虫基因组DNA,评价其检测特异性。结果从溪蟹样本中分离出斯氏并殖吸虫、卫氏并殖吸虫和三平正并殖吸虫囊蚴,经分子鉴定和系统进化分析确认其与Gen Bank中并殖吸虫标准株基因序列具有同源性。成功建立了斯氏并殖吸虫荧光RAA检测方法,可在5 min内扩增到河南省济源市和洛阳市宜阳县采集的斯氏并殖吸虫囊蚴基因组DNA,而阴性对照无扩增。以重组质粒为模板,荧光RAA法最低检出限为10拷贝/μL重组质粒,且均在5 min内出现阳性扩增;以基因组DNA为模板,可检测到的最低模板DNA浓度为10 pg/μL,且均在10~15 min内出现阳性扩增。荧光RAA法检测卫氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫、日本血吸虫和华支睾吸虫基因组DNA结果均为阴性。结论成功建立了一种基于荧光RAA技术的快速、敏感、特异的斯氏并殖吸虫核酸检测方法,在斯氏并殖吸虫病流行区溪蟹现场快速检测与虫种鉴定中具有潜在应用价值。

重组酶介导的核酸等温扩增荧光法快速检测日本血吸虫感染性钉螺

目的建立重组酶介导的核酸等温扩增荧光(Recombinase aided amplification,RAA)法快速检测日本血吸虫感染性钉螺技术,并探索钉螺样品的最佳处理方式。方法将钉螺样本分成3组,每组均含7个亚组,其中6个亚组分别为50只阴性钉螺中混合1、2、3、4、5、10只日本血吸虫感染性钉螺,1个亚组为100只阴性钉螺中混合1只感染性钉螺。3组钉螺分别采用压碎去壳核酸试剂盒提取法、压碎去壳核酸粗提法和直接压碎带壳核酸粗提法进行处理,并分别进行荧光RAA与PCR法检测,对检测结果进行比较。结果建立了荧光RAA检测技术,工作温度为39℃,30 min内即可完成日本血吸虫感染性钉螺检测。钉螺群体样本采用压碎去壳核酸试剂盒提取法处理后,荧光RAA法最低可检测到100只阴性钉螺中混合1只感染性钉螺,PCR法最低可检测到50只阴性钉螺中混合1只感染性钉螺;采用压碎去壳核酸粗提法处理后,荧光RAA法最低可检测到100只阴性钉螺中混合1只感染性钉螺,PCR法最低可检测到50只阴性钉螺中混合3只感染性钉螺;采用直接压碎带壳核酸粗提法处理后,荧光RAA法最低可检出50只阴性钉螺中混合10只感染性钉螺,PCR法仅可检测出50只阴性钉螺中混合10只感染性钉螺。结论成功建立了钉螺群体样本中日本血吸虫感染性钉螺快速检测的荧光RAA法,该方法具有快速、灵敏、操作简便等特点;压碎去壳核酸粗提法为钉螺样品的最优处理方式。

重组酶介导的等温核酸扩增技术检测多房棘球绦虫方法的建立及初步应用

目的基于重组酶介导的等温扩增技术(Recombinase-aided isothermal amplification assay,RAA)建立一种快速检测多房棘球绦虫的核酸检测方法,并进行检测效果评价。方法以多房棘球绦虫线粒体基因序列(GenBank登录号:AB018440)作为靶序列,根据RAA反应原理设计并合成引物,利用该引物进行RAA扩增。以聚合酶链反应(PCR)作为平行对照,应用RAA方法扩增不同稀释浓度的多房棘球绦虫基因组DNA及梯度稀释的含不同拷贝数目的基因片段的pMD19-T(Simple)克隆质粒,以评价RAA检测的敏感性。应用此方法检测细粒棘球绦虫(G1型)、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首鞭形线虫、蓝氏贾第虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫以及华支睾吸虫基因组DNA,以评价其特异性。在对建立的方法进行条件优化后,检测9份感染多房棘球蚴的动物组织样本、3份模拟现场多房棘球蚴感染阳性犬粪样本以及2份现场阳性犬粪样本,以验证所建立的RAA方法的可靠性和实用性。结果所建立的RAA法可在40 min内特异性扩增多房棘球绦虫目的基因片段。以多房棘球绦虫基因组DNA为模板,RAA法最低检测量为10 pg;以重组质粒为模板,RAA法最低可检出的质粒拷贝数为10^4个。以细粒棘球绦虫(G1型)、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首鞭形线虫、蓝氏贾第虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫以及华支睾吸虫基因组DNA为模板,应用所建立的RAA法扩增结果均为阴性。应用本研究建立的RAA法检测感染多房棘球蚴的动物组织样本以及模拟和现场阳性犬粪便样本结果均为阳性,且与PCR法检测结果一致。结论本研究建立了一种反应快捷、敏感性和特异性均较高的RAA检测方法,其在多房棘球绦虫虫种鉴定以及棘球蚴病基因诊断方面展现出较好应用前景。

重组酶介导的隐孢子虫属特异性等温核酸扩增方法的建立及评价

目的建立一种可用于隐孢子虫检测的重组酶介导的等温核酸扩增(RAA)方法,并对其检测敏感性和特异性进行评价。方法以隐孢子虫属特异性18S rRNA核酸序列作为检测靶标,采用Amplfix软件设计、合成引物及荧光检测探针,构建并优化RAA荧光反应体系;分别以不同拷贝数的含18S rRNA靶序列的重组质粒、不同浓度隐孢子虫卵囊基因组DNA及不同数量隐孢子虫卵囊基因组DNA为模板进行RAA荧光法检测,以评价其敏感性;分别以隐孢子虫卵囊、蓝氏贾第鞭毛虫包囊、日本血吸虫虫卵、似蚓蛔线虫虫卵、华支睾吸虫虫卵、沙门氏菌、志贺氏菌基因组DNA为模板进行RAA荧光法检测,以评价其特异性。结果成功建立了隐孢子虫检测RAA法,该方法可在39℃、20 min内得到隐孢子虫属18S rRNA基因片段的有效扩增。以不同拷贝数的含18S rRNA靶序列的重组质粒、不同浓度隐孢子虫卵囊基因组DNA及不同数量隐孢子虫卵囊基因组DNA为模板,该方法最低检出限分别为102拷贝/μL、1 pg/μL和1个/50μL;以蓝氏贾第鞭毛虫包囊、日本血吸虫虫卵、似蚓蛔线虫虫卵、华支睾吸虫虫卵、沙门氏菌、志贺氏菌基因组DNA为模板的荧光RAA扩增结果均为阴性。结论成功建立了一种可用于检测隐孢子虫卵囊DNA的RAA法,该方法操作简便、反应快速,敏感性和特异性均较好。

基于重组酶介导等温扩增技术的3种棘球绦虫核酸检测方法的建立及初步应用

目的基于重组酶介导的等温扩增技术(recombinase-aided isothermal amplification assay,RAA)建立一种快速检测多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫的多重核酸检测方法,并对其检测效果进行初步评价。方法分别以多房棘球绦虫(GenBank登录号:NC 000928)、细粒棘球绦虫(GenBank登录号:NC044548)和石渠棘球绦虫(GenBank登录号:NC009460)线粒体基因组序列为靶序列,依据RAA引物设计基本原则设计、合成3对引物,并进行多重RAA扩增。分别扩增不同浓度3种棘球绦虫基因组DN A和不同浓度含3种靶基因的重组质粒,以评价多重RAA检测方法的敏感性;同时采用该方法检测3种棘球绦虫及多头带绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫、犬复孔绦虫、泡状带绦虫、犬弓首蛔虫、肝片形吸虫、豆状带绦虫、中线绦虫和犬隐孢子虫基因组DNA,以评价该方法的特异性。优化建立的多重RAA法的条件,再检测棘球蚴病病变组织样本、模拟犬粪便样本和现场狐狸粪便样本,以评价该方法的应用价值。结果所建立的多重RAA检测方法可在39℃时40 min内特异性扩增多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫线粒体基因片段,长度分别约为540、430 bp和200 bp。该多重RAA法对多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫基因组DNA的最低检测限为2.0、2.5 pg/μL和3.1 pg/μL,对含多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫靶基因的重组质粒的最低检测限均可达到200拷贝/μL;该多重RAA法可以同时检测出多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫单一感染和多重感染,对多头带绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫、犬复孔绦虫、泡状带绦虫、犬弓首蛔虫、肝片形吸虫、豆状带绦虫、中线绦虫和犬隐孢子虫无扩增。优化后的多重RAA法能够检测出全部棘球蚴病病变组织样本及模拟犬粪样本和现场狐狸粪便样本中的阳性样品,且与单一PCR法检测结果完全一致。结论成功建立了一种可用于多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫基因组DN A快速检测的多重RAA法,特异性和敏感性均较高。