快速检测十足目虹彩病毒1 RPA-LFD方法的建立及初步应用

为建立一种高效、快速、简便的十足目虹彩病毒1(DIV1)检测方法,本研究以DIV1 ATPase基因为检测靶标,设计特异性引物和探针,采用方阵法优化反应温度和时间,结果显示,重组酶聚合酶扩增技术(RPA)最优反应温度为37℃,时间为15 min,结果观察时间为5 min,检测过程总时长为20 min,初步建立了DIV1的重组酶聚合酶扩增技术结合侧向流试纸条方法(RPA-LFD)。提取其他7种常见虾类病原基因组与DIV1基因组,采用该方法检测,分析其特异性;构建重组质粒标准品p UC57-DIV1,10倍倍比稀释后采用该方法检测,分析其灵敏性;以3种不同浓度的重组质粒标准品为模板进行批间、批内重复性试验。结果显示,该方法能特异性检测DIV1,与虾类其他常见易感病原均无交叉反应;其对重组质粒标准品的检测限为1×10^(1)拷贝/μL;批内和批间重复性试验的检测结果均一致,重复性好。利用该方法与已发表的荧光定量PCR(qPCR)同时检测15份感染DIV1的罗氏沼虾样品及40份临床样品,结果显示,该方法的阳性检测率为69.09%(38/55),阴性率为30.91%(17/55),与q PCR检测结果一致,二者的阳性符合率、阴性符合率、总符合率均为100%。综上所述,本研究建立的RPA-LFD方法检测DIV1具有快速、简便、灵敏度高且特异性强的特点,且不需要精密昂贵的仪器设备,为基层实验室及现场检测提供了可行技术手段。

甘薯褪绿矮化病毒西非株系RT-RPA-LFD检测方法的建立与应用

【目的】利用逆转录酶重组酶聚合酶扩增(reverse transcriptase recombinase polymerase amplification,RT-RPA)结合侧向流层析(lateral flow dipstick,LFD)试纸条技术,建立甘薯褪绿矮化病毒(sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)西非株系(west African strain,WA)的RT-RPA-LFD检测方法。【方法】根据SPCSV-WA外壳蛋白基因和热激蛋白基因的保守序列设计并筛选扩增效果好、特异性强的引物和探针。然后对引物和探针的浓度、扩增体系、温度、反应时间等条件进行优化,建立SPCSV-WA的RT-RPA-LFD检测方法。利用该方法对SPCSV-EA、甘薯羽状斑驳病毒(sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)、甘薯潜隐病毒(sweet potato latent virus,SPLV)、甘薯G病毒(sweet potato virus G,SPVG)等常见的甘薯病毒进行检测,验证方法的特异性;将感染SPCSV-WA甘薯叶片样品总RNA进行10倍梯度稀释,分别采用RT-PCR和RT-RPA-LFD进行检测,比较RT-PCR和RT-RPA-LFD方法的灵敏度;对采自田间的甘薯样品和试管苗样品进行RT-RPA、RT-RPA-LFD和RT-PCR检测,验证该方法的实用性。【结果】建立了SPCSV-WA的RT-RPA-LFD检测方法,最适引物为CSV357F/R,探针CSV-CP-Probe(47 bp),引物和探针工作浓度分别为0.2和0.06μmol·L-1,温度为42℃,时间5 min。该方法可对SPCSV-WA进行特异性检测,与甘薯上其他常见病毒无交叉反应。RT-RPA-LFD最低可检测到总RNA稀释至10-4溶液,而RT-PCR最低检测到总RNA稀释至10-3溶液,RT-RPA-LFD灵敏度是RT-PCR的10倍。田间采集的22份甘薯样品经RT-PCR、RT-RPA和RT-RPA-LFD检测,均检出11份阳性样品,3种方法检测结果一致。28份试管苗样品的检测结果表明,RT-PCR和RT-RPA-LFD检测结果一致,均检出5份阳性样品。【结论】建立了SPCSV-WA的RT-RPA-LFD检测方法,该方法具有快速、简便、特异、灵敏、可视的特点,既可用于甘薯脱毒试管苗样品的病毒检测,也适用于基层单位田间甘薯病毒样品的现场快速检测。

嗜水气单胞菌RPA-LFD快速检测方法的建立

文章旨在建立一种针对嗜水气单胞菌的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法。研究根据嗜水气单胞菌促旋酶B亚单位(gyrase subunit B,gyrB)基因的保守序列,设计特异性重组酶聚合酶扩增技术(RPA)扩增引物,通过结合琼脂糖凝胶电泳(AGE)和侧流层析试纸条(LFD)的方法进行反应条件的优化、特异性及灵敏度检测。实验结果表明,所建立的嗜水气单胞菌RPA-LFD快速检测方法可在38℃最适温度下30min内无干扰地检测到嗜水气单胞菌,对嗜水气单胞菌纯培养物和基因组DNA的最小检出限为10^(3)cfu/mL和100 pg/μL。利用建立的RPA-LFD与普通PCR同时检测杂交鲟鱼处理临床样品的结果表明,两种方法的结果一致。综上所述,通过对RPA反应条件的探索和优化,成功建立了嗜水气单胞菌快速检测方法。该方法操作简便,反应迅速,与普通PCR相比,不需要昂贵的仪器,为未来嗜水气单胞菌细菌性疾病的早期诊断提供了更有效的技术支持。

基于RPA-LFD法的多黏菌素耐药基因mcr-1可视化快速检测方法建立与应用

目的:建立一种快速、高效、可视化的细菌多黏菌素耐药基因mcr-1检测方法,为其基层检测的展开提供依据和便利。方法:利用重组酶聚合酶扩增结合胶体金侧向流试纸条技术(Recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow dipstick,RPA-LFD),辅以手持式胶体金读数仪;根据mcr-1基因保守序列设计合成一对特异性RPA引物,通过对反应条件和体系的优化,以及特异性试验、灵敏度试验、模拟食样试验和实际样品试验,成功建立了可视化定量检测细菌多黏菌素耐药基因mcr-1的RPA-LFD方法。结果:在引物浓度400 nmol/L,引物比例1:1时,该方法最佳反应条件为Mg^(2+)浓度14.0 mmol/L,反应温度37℃,反应时间20 min;灵敏度好,标准曲线方程为y=0.117x+0.051,定量限为10^(1)~108 copies/μL,检出限为10^(1)copies/μL,比PCR法低一个数量级且模拟样品检出结果与PCR法一致。利用建立的RPA-LFD法对猪肉样品、鸡肉样品、生猪养殖场环境样品、肉鸡养殖场环境样品、大肠杆菌分离株和弯曲肠杆菌分离株各15份中多黏菌素耐药基因mcr-1携带情况进行分析;RPA-LFD法与常规PCR法阳性样本检出率一致,共检出9份mcr-1基因阳性样品。RPA-LFD定量分析显示,阳性样品中mcr-1基因浓度在4.5×10^(2)~8.6×10^(4)copies/μL之间。结论:本研究建立的细菌多黏菌素耐药基因mcr-1的RPA-LFD检测法特异性强、灵敏性高、操作简单,可广泛应用于基层检验。

布鲁氏菌RPA-LFD检测方法的建立

为建立一种快速,便于现场检测布鲁氏菌的方法,本研究基于布鲁氏菌(Brucella)Omp31基因的保守片段设计并合成引物和探针,通过对反应条件优化建立了布鲁氏菌重组酶聚合酶-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,对该方法进行特异性、敏感性、重复性检测。结果显示该检测方法在39℃反应20 min以上便可肉眼观察到明显结果。特异性试验结果显示除布鲁氏菌基因组呈阳性外,维氏气单胞菌、大肠杆菌、甲型副伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、乙型溶血性链球菌均为阴性,特异性较强;敏感性试验结果显示,该方法最低可检测到101拷贝/μL的质粒标准品,比常规PCR高出100倍,敏感性较高;重复性试验结果显示,3次批间重复试验无明显差异,稳定性良好。利用该方法检测34份临床样品,其检测结果与普通PCR检测结果符合率为100%。本研究建立了一种快速检测布鲁氏菌的方法,该方法不需要特殊的仪器,操作简便,灵敏度高,肉眼即可观察到结果,为布鲁氏菌病的现场快速诊断提供了帮助。

鸡毒支原体和滑液囊支原体双重LFD-RPA快速检测方法的建立

【目的】鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)和滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是对家禽危害最大的两种支原体,MG、MS的早期诊断是预防和控制禽支原体的关键环节。通过将重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)和测流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)相结合,建立一种操作便捷、反应快速、结果可视化、可同时检测MG、MS两种病原的快速检测方法。【方法】基于MG的mgc2基因、MS的vlhA基因设计特异性引物和探针,优化反应时间、反应温度及引物配比建立双重LFD-RPA快速检测方法,评价其灵敏度、特异性、稳定性,同时对120份临床样品进行检测。【结果】双重LFD-RPA检测方法在37℃下反应5-10min即可完成扩增,其RPA-MG-F2/R2、RPA-MS-F1/R1最佳引物配比为0.6∶1.4。MG、MS的最低检出限分别为3.75 copies/μL、3.46 copies/μL。用该方法与OIE推荐的PCR方法对120份样品进行检测,二者符合率为93.3%。【结论】MG、MS双重LFD-RPA检测方法在恒温条件下即可完成扩增,其操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好,无需使用任何仪器即可观察到结果,适用于基层MG、MS单独感染或混合感染的现场快速检测。

重组酶聚合酶扩增技术结合侧流层析试纸条快速检测新加坡石斑鱼虹彩病毒

为建立一种快速灵敏、可视化的适用于临床样品检测新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)的方法,本研究针对SGIV特异基因ORF014L序列设计特异性引物及探针,建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术及结合侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)(RPA-LFD)的SGIV检测技术。RPA反应使用10μmol/L的引物浓度,在40.1℃恒温反应20 min即可完成特异性病毒的检测,最低检测限为102个/μL标准质粒。RPA-LFD反应在42℃恒温反应8 min可将检测结果通过试纸条可视化呈现,最低检测限为101个/μL标准质粒,且不与其他常见水生动物病原发生交叉反应,临床样品检测结果也与PCR检测结果一致。RPA、RPA-LFD均能特异性检测SGIV,两者的检测限均比常规PCR灵敏。RPA-LFD法具有快捷简单、结果可视化的特点,在临床应用具有较好的应用前景。

可视化RPA-LFD技术快速检测猪链球菌

旨在建立一种可视化、操作简便的猪链球菌快速检测技术。针对猪链球菌种特异性基因谷氨酸脱氢酶(gdh)序列设计特异性引物,建立可同时检测出所有血清型的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测技术,优化反应温度与反应时间,评价其特异性与灵敏度,同时利用该法对45例疑似猪链球菌感染标本进行检测。结果显示:猪链球菌RPA-LFD法检测灵敏度可达100拷贝·μL^(-1),优于常规PCR方法,且不与其他常见病原菌发生交叉反应。扩增反应可在较宽温度范围(30~45℃)内高效进行,20~30 min可完成检测。利用临床45例疑似猪链球菌感染样本对检测体系进行评估,其检出率高于细菌分离与常规PCR方法,具有较强的实用性。本研究建立的猪链球菌RPA-LFD检测方法具有强特异性、高灵敏度、易于操作的特点,同时不依赖于仪器、专业操作人员,适用于野外及现场检测。

鸡传染性喉气管炎病毒RPA-LFD检测方法的建立

为建立一种简便、快捷的现地检测鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的方法,本研究联合重组酶聚合酶扩增(RPA)和侧向流试纸条(LFD)技术,在优选的RPA上、下游引物的5'端分别进行异硫氰酸荧光素和生物素标记,通过引物浓度、RPA反应时间和温度等条件的优化建立了一种可以用于ILTV现地检测的RPA-LFD方法。该检测方法在30℃～42.5℃恒温反应20 min即可实现对ILTV目的基因片段的有效扩增;与其它常见禽病病原DNA无交叉反应;RPA扩增产物直接用胶体金侧向流免疫层析试纸条肉眼观察,最低检测限为100拷贝/μL,比常规PCR灵敏度高100倍。结果表明,本研究建立的RPA-LFD检测方法灵敏度高,操作方便,可用于ILTV的临床快速检测。

可视化核酸检测技术RPA-LFD的研究和应用进展

重组酶聚合酶扩增技术(recombinase ploymeraseamplication,RPA)是一种新型恒温核酸扩增技术,与PCR相比,操作简便,反应快速,灵敏度高,特异性强,无需精密仪器,是一种可以替代PCR的核酸检测技术,被认为是目前最有潜力成为快速分子诊断的工具。RPA与横向流动试纸条(lateral flowdipstick,LFD)结合的RPA-LFD技术,可实现扩增产物的可视化检测,在病原体现场核酸快速检测中具有良好的应用前景,这为实验动物的质量监督检验提供了一种新的方法。本文对RPA-LFD这一新型核酸检测方法的技术原理、研究现状、技术瓶颈及用于现场核酸提取的研究进展进行综述。

可视化RPA-LFD技术快速检测美人鱼发光杆菌

目的:利用双重重组酶聚合酶扩增结合侧流层析技术(duplex recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow dipstick,RPA-LFD)建立了一种能快速可视化鉴定美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检测方法。方法:以美人鱼发光杆菌特异性基因bamB及其美人鱼亚种特异性基因ureC为检测靶标基因,设计特异性RPA引物,建立双重RPA-LFD方法。结果:在bamB引物终浓度为400 nmol/L,ureC引物终浓度为400 nmol/L,反应温度为37℃,反应时间为15 min时,双重RPA-LFD方法扩增效率最高,且特异性好。检测灵敏度为101 CFU/mL。实际样品检测试验中,与qPCR法结果一致。结论:建立的双重RPA-LFD方法具有检测速度快、灵敏度高且检测结果可视等优点,从而为快速鉴定美人鱼发光杆菌及其亚种提供了准确有效的方法,在基层和现场检查中具有较好的应用前景。

猪流行性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增快速诊断方法的建立和应用

旨在建立一种针对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法。以猪流行性腹泻病毒cDNA为模板,在重组酶和聚合酶的共同作用下实现对目的基因的扩增,本研究设计了用于重组酶聚合酶扩增的引物,优化了重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)反应体系,检测了反应的特异性和敏感性,确定了反应的最佳温度和时间,通过结合琼脂糖凝胶电泳和侧流层析试纸条的方法进行分析和鉴定。试验结果显示反应的最佳温度和时间为30℃、20 min,反应可以检测到的最低质粒拷贝数为102 copies·μL^(-1),且在对猪的丁型冠状病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒和圆环病毒2型的检测中具有良好的特异性。综上所述,通过对RPA反应条件的摸索与优化,成功建立了猪流行性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增结合琼脂糖凝胶电泳(Basic RPA)和侧流层析试纸条(LF-RPA)的检测方法,两种方法相比较于RT-PCR,有更短的检测时间且具有更高的敏感性,对仪器、场地和检测环境的要求更低,为今后PEDV的临床诊断及快速检测提供了更多的选择和更有效的技术支持。

重组酶聚合酶扩增技术结合侧向流动试纸条快速检测锦鲤疱疹病毒

为建立一种快速、灵敏并适用于临床检测Ⅲ型鲤疱疹病毒(CyHV-3,KHV)的方法,实验根据KHV SphI-5基因的保守序列片段设计引物及探针,采用重组酶聚合酶扩增技术结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测KHV。重组酶聚合酶扩增技术(RPA)具恒温扩增及高灵敏度特点,简化了设备要求的同时又能做到高效检测病毒,再结合侧向流动试纸条(LFD)将RPA结果快速地可视化,提高了该疾病的检测效率。结果表明,在38℃的最适反应温度下,采用RPA-AGE技术仅需10min便可检测出病原的目标片段,结合LFD方法仅需5min便可将RPA结果通过试纸条可视化呈现。研究研发的KHV RPA-LFD检测方法简单、快捷,可为实验条件有限的养殖场快速诊断需求提供技术支撑。

烟草靶斑病LFD-RPA快速检测方法的建立

烟草靶斑病是由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)侵染引起的烟草叶部病害,近年来在我国部分省份发生严重,危害烟草生产。为开发烟草靶斑病的早期快速诊断方法,本研究根据该病原菌的内转录间隔区(ITS),设计了重组酶聚合酶扩增技术相关引物RsRPA-F3/R3,建立了一种靶斑病菌的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(LFD-RPA)检测方法。该方法能够在37℃,15 min内特异性地检测到R.solani(1.40×10^(2) copies/µL)质粒DNA,与常规PCR灵敏度一致。在田间烟草靶斑病实时检测中,准确率达95.83%。本方法具有快速、简单、可视化等特点,为烟草靶斑病菌的田间快速诊断提供了技术支撑。

塞尼卡谷病毒重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条检测方法的建立

为建立塞尼卡谷病毒(SVV)重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,本研究针对SVV 3D基因设计了引物和探针,通过反应条件优化、特异性、灵敏性和重复性试验,建立了SVV RPA-LFD检测方法。特异性试验结果显示,该方法与口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒无交叉反应;在40℃、20 min内可检测的最低浓度为56拷贝/μL质粒标准品;通过3次重复试验检测,LFD检测线灰度值变异系数范围在4.49%~9.73%。利用该方法对120份国内临床样品进行检测,结果均为阴性。本研究首次建立了检测SVV的等温、快速RPA-LFD方法,读取结果不依赖任何仪器设备,为猪群感染SVV的现场快速诊断、流行病学研究和根除方案的制定提供帮助。

重组酶聚合酶扩增反应结合侧流层析试纸条技术快速鉴别大西洋鳕鱼制品真伪

建立了重组酶聚合酶扩增反应(recombinase polymerase amplification,RPA)结合侧流层析试纸条技术(RPA-lateral flow dipstick,RPA-LFD)快速鉴别大西洋鳕鱼制品真伪的方法。对比大西洋鳕鱼和常用来冒充鳕鱼的鱼类线粒体基因组序列,设计针对大西洋鳕鱼的特异性探针和引物,建立针对大西洋鳕鱼的RPA-LFD检测方法。该实验筛选最佳引物和探针并评估其特异性,优化反应温度、时间和现场检测条件,并对20份市售“大西洋鳕鱼”及常见的冒充鳕鱼的鱼类制品进行现场检测,评估检测效果。实验结果表明,RPA-LFD检测方法特异性强,在44℃、14 min条件下的检测效果最好。在现场开展快速检测,效果良好,20份鳕鱼制品检测结果经过基因测序证实和产品真实成分一致。该研究建立的大西洋鳕鱼RPA-LFD检测方法特异性强、反应耗时短、操作简便、结果可视,有良好的现场快速检测应用前景,为大西洋鳕鱼制品现场快速检测提供了新思路,为水产品市场监管提供了技术支持。

基于重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条快速检测鲤疱疹病毒2型的方法研究

为建立CyHV-2的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析(RPA-LFD)快速检测鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的方法,针对鲤疱疹病毒2型的DNA聚合酶基因设计引物和探针,优化反应温度和时间条件,建立了鲤疱疹病毒2型的RPA-LFD检测方法,并将样品简易处理方法运用于该方法对实验室保存的鲫组织样品进行检测。结果显示,该RPA-LFD检测方法最佳反应条件为40℃20 min,最低检出限为6×10^(0) copies/μL,与荧光PCR的灵敏度相当,与其他鲤疱疹病毒等无交叉反应;运用该方法并结合待检样品简易处理方法(直接RPA法)对50份鲫组织样品进行处理和检测,其结果与运用国家标准(GB/T 36194-2018)中荧光PCR方法检测结果一致。本文建立的RPA-LFD检测方法具有操作简单、反应迅速、灵敏度高、特异性强的优点,适于在水产养殖场和基层部门用于鲤疱疹病毒病的辅助诊断和监测。

马铃薯腐烂茎线虫RPA-LFD可视化快速检测方法的建立

马铃薯腐烂茎线虫是为害我国甘薯和马铃薯的一种重要植物病原线虫,也是我国重要的检疫性有害生物。为实现对该线虫的准确、快速且可视化的检测,本研究以马铃薯腐烂茎线虫rDNA-ITS序列为靶标构建了重组酶聚合酶结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)的可视化快速检测体系。该体系可在39℃条件下15 min内特异性地完成对马铃薯腐烂茎线虫的检测,对A型(甘薯种群)和B型(马铃薯种群)单头线虫(J4)的检出底限均为3125-1头线虫,可以直接对土壤和甘薯茎中的马铃薯腐烂茎线虫进行检测,灵敏度可达1头(J4)/10 g土壤和1头(J4)/2 g甘薯茎组织。该体系操作简便、成本低廉、结果可视,可为马铃薯腐烂茎线虫的早期预警和口岸检疫提供技术支撑。

禽腺病毒血清4型RPA-LFD快速检测方法的建立

为了建立一种快速、灵敏、简便的禽腺病毒血清4型(FAdV-4)现场检测方法,本试验将重组酶聚合酶扩增(RPA)与胶体金侧向流试纸条(LFD)技术联合,设计针对FAdV-4hexon基因的特异性RPA引物,上、下游引物的5′端分别进行6-羧基荧光素(FAM)和生物素(Biotin)标记。通过对引物浓度、RPA反应时间和温度等条件的优化,建立了一种可用于FAdV-4现场检测的RPA-LFD方法。该检测方法在25～45℃恒温反应15 min即可实现对FAdV-4目的基因片段的有效扩增,RPA扩增产物用胶体金侧向流试纸条进行检测,检测结果肉眼可见。该方法的最低检测限为100拷贝,敏感性是常规PCR的100倍,且与其他常见禽病病原核酸检测无交叉反应。结果显示,本试验建立的RPA-LFD可用于FAdV-4的临床快速检测,为FAdV-4感染的流行病学检测提供了一种有效方法。

牛病毒性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)快速诊断方法的建立与应用

本研究开发了一种基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术结合侧流层析试纸条(LFD)快速检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的方法。该方法根据5′-UTR保守序列设计nfo RPA特异性引物和探针,35℃孵育25 min即可完成对BVDV核酸的识别与扩增,室温条件下仅需5 min便可肉眼在试纸条上观察到结果。结果显示,该方法最低检测限为60 copies/μL,且仅能够检测出BVDV1型和2型,与猪瘟病毒(CSFV)、传染性牛鼻气管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)等其他病毒无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。对临床样本的检测结果表明,该方法的测定性能与RT-qPCR一致,且RPA-LFD操作更加快速便捷,更适合现场环境中使用。