重组酶介导等温扩增技术(RAA)在病原微生物检测中的应用进展

重组酶介导等温扩增(RAA)是一种恒温快速核酸扩增技术,是重组酶等温扩增技术中具有代表性和前沿性的检测技术,其弥补了现有核酸体外扩增技术需要热循环的局限性,使得核酸体外扩增更加简便快捷,目前已被广泛应用于动物疫病检测。本文介绍了RAA技术的检测原理、引物探针设计及优缺点,综述了其在病毒、细菌、寄生虫及抗生素耐药基因检测等方面的应用进展,总结了国内现有RAA技术标准及检测产品开发情况,以期为拓展RAA技术的应用提供参考。

口蹄疫病毒通用型RT-RAA-LFD快速检测方法的建立

为建立一种操作简便、有效的口蹄疫病毒(FMDV)核酸通用型检测方法,以FMDV 3D基因为靶基因,设计标记引物及探针,建立了一种新的检测FMDV的反转录-重组酶介导链置换核酸扩增结合侧流层析试纸检测(RT-RAA-LFD)方法。该方法操作简便,耗时短,40℃35 min内即可完成检测,通过肉眼观察可判定结果;具有较好的覆盖面,能够检出我国O型、A型FMDV主要流行拓扑型病毒,与猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)等其他猪病病原无交叉反应;对RNA标准品的最低检测限为10^(-7)拷贝/μL,敏感性较高。利用建立的FMDV RT-RAA-LFD方法对5份临床样品进行检测,其结果与RT-PCR结果一致。结果表明,本研究建立的FMDVRT-RAA-LFD方法具有快速、直观、特异强、重复性好等优点,适合在基层兽医防疫部门和养殖场推广应用。

GⅠ和GⅡ诺如病毒RAA可视化快速检测方法的建立

诺如病毒(NoV)是引起全球急性肠胃炎疾病的主要病原体之一,极易爆发传播,增加医疗与经济负担。目的:通过重组酶介导等温扩增技术(RAA)开发一种新型的NoV检测方法。方法:根据ISO TS 15216-2-2013、GB 4789.42规定的GⅠ和GⅡ NoV检测靶标所对应的cDNA序列,设计并筛选最佳RAA引物及探针,确定其对其它常见食源性腹泻病毒的特异性。通过优化确定最短检测时间、反应程序以及反应体系,分析该检测体系下对NoV参考质粒和真实样本检测的灵敏度,从而建立GⅠ和GⅡ NoV RAA可视化快速检测方法。结果:所建立的RAA检测方法特异性好,与其它食源性病毒无交叉反应。在保证扩增效率的前提下,优化后的反应程序可将检测时间缩短为10 min左右,反应成本可减少三分之二。对参考质粒和真实样本检测的灵敏度分别达10^(-2)ng/μL和1 ng/μL。结论:本试验建立的两种NoV检测方法特异性强、灵敏度高,且简单、快速、可视,为今后NoV快速检测奠定良好的基础。

猪瘟病毒新型检测技术的研究进展

猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)是一种能引起猪只急性、热性和全身性败血性疾病的RNA病毒,妊娠母猪、种用公猪感染后分别表现为繁殖障碍和精液带毒,仔猪感染后出现神经症状。我国是生猪养殖和消费大国,生猪养殖量和存栏量均占全球总量一半以上,加上生猪养殖规模化程度低,生猪调运频次高、数量多,一旦爆发猪瘟会给我国生猪养殖业带来重大经济损失。笔者总结了近年来CSFV的检测技术,传统检测技术包括酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR),新型检测技术包括免疫层析试纸条、免疫色谱横向流动检测(immuno-chromatographic lateral flow assay,LFA)、抗原捕获酶免疫分析(antigen-capture enzyme immunoassay,EIA)、化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassays,CLIA)、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、重组酶介导扩增(recombinase-aid amplifacation,RAA)、微滴式数字PCR(microdroplet digital PCR,ddPCR)及其他新型检测技术等,分析上述检测方法的优缺点,以期为临床上检测猪瘟病毒提供可靠有效的方法指导。

重组酶扩增技术概述及应用研究进展

重组酶扩增技术是近几年快速发展起来的一类等温扩增技术,相对于传统的核酸检测方法,具有设备要求低、操作简单等优势,在现场快速检测方面有着广阔的应用前景。本文简要介绍了重组酶扩增技术的技术原理、优点和难点,重点阐述了其在病毒、细菌、寄生虫及其他微生物检测领域的应用研究进展,旨在为重组酶扩增技术的进一步发展与应用提供参考。

猪圆环病毒3型RAA检测方法的建立及初步应用

为建立猪圆环病毒3型(PCV3)的快速简便检测方法,根据PCV3 Cap基因的保守序列设计多对引物和探针,建立了一种实时荧光RAA检测方法。通过筛选引物和优化试验条件,验证对常见动物疾病病毒的特异性,并与PCR方法在敏感性上进行比较。结果表明,PCV3与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪A型塞内卡病毒(SVA)和口蹄疫病毒(FMDV)等核酸无交叉反应,可在39℃下20 min内快速特异完成。该方法灵敏度较高,最低检出浓度为10^2copies/μL。应用该方法对115份猪临床样品进行检测,检测结果与PCR方法一致。结果表明,该方法操作简单、快速灵敏、结果可靠,可用于PCV3的实验室检测和现场诊断。

重组酶介导的等温核酸扩增技术检测多房棘球绦虫方法的建立及初步应用

目的基于重组酶介导的等温扩增技术(Recombinase-aided isothermal amplification assay,RAA)建立一种快速检测多房棘球绦虫的核酸检测方法,并进行检测效果评价。方法以多房棘球绦虫线粒体基因序列(GenBank登录号:AB018440)作为靶序列,根据RAA反应原理设计并合成引物,利用该引物进行RAA扩增。以聚合酶链反应(PCR)作为平行对照,应用RAA方法扩增不同稀释浓度的多房棘球绦虫基因组DNA及梯度稀释的含不同拷贝数目的基因片段的pMD19-T(Simple)克隆质粒,以评价RAA检测的敏感性。应用此方法检测细粒棘球绦虫(G1型)、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首鞭形线虫、蓝氏贾第虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫以及华支睾吸虫基因组DNA,以评价其特异性。在对建立的方法进行条件优化后,检测9份感染多房棘球蚴的动物组织样本、3份模拟现场多房棘球蚴感染阳性犬粪样本以及2份现场阳性犬粪样本,以验证所建立的RAA方法的可靠性和实用性。结果所建立的RAA法可在40 min内特异性扩增多房棘球绦虫目的基因片段。以多房棘球绦虫基因组DNA为模板,RAA法最低检测量为10 pg;以重组质粒为模板,RAA法最低可检出的质粒拷贝数为10^4个。以细粒棘球绦虫(G1型)、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首鞭形线虫、蓝氏贾第虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫以及华支睾吸虫基因组DNA为模板,应用所建立的RAA法扩增结果均为阴性。应用本研究建立的RAA法检测感染多房棘球蚴的动物组织样本以及模拟和现场阳性犬粪便样本结果均为阳性,且与PCR法检测结果一致。结论本研究建立了一种反应快捷、敏感性和特异性均较高的RAA检测方法,其在多房棘球绦虫虫种鉴定以及棘球蚴病基因诊断方面展现出较好应用前景。

逆转录重组酶介导的等温扩增技术快速检测甲型H1N1流感病毒

利用逆转录重组酶介导的等温扩增技术(Reverse transcription-recombinase aided amplification, RT-RAA)与RT-RAA单链荧光探针结合,建立甲型H1N1流感病毒(Influenza A virus H1N1, FLU A H1N1)的快速分子检测方法。设计RT-RAA引物和荧光探针,用于FLU A H1N1模板核酸的等温扩增和荧光检测,以评价优化方法的灵敏度与特异性;将实时荧光定量PCR(real-time PCR)作为对照方法,测试RT-RAA荧光方法对临床样本的检测效果。FLU A H1N1的RT-RAA荧光检测方法能在30 min内完成检测,灵敏度达到10^(1)拷贝/μL;特异性试验表明,其与十六种常见呼吸道传染性病毒均无交叉反应。49份临床样本检测结果和real-time PCR检测结果一致性高(Kappa=0.958),临床灵敏度为100%,临床特异性为95.2%。建立的RT-RAA荧光检测方法检测时间短,灵敏度高,特异性强,适用于FLU A H1N1的快速检测。

重组酶介导等温核酸扩增技术检测细粒棘球绦虫方法的建立及初步应用评价

目的建立一种新的敏感、特异且能快速检测细粒棘球绦虫G1的重组酶介导扩增技术(Recombinase aided isothermal amplification,RAA)。方法以细粒棘球绦虫G1(E.granulosus G1,EgG1)线粒体基因序列(GenBank No.AF297617)作为靶序列设计合成引物,以EgG1 DNA为模板进行RAA扩增,反应产物预期大小为284 bp。以聚合酶链式反应(PCR)作为平行对照,应用RAA扩增不同稀释浓度的基因组DNA及梯度稀释的含目的基因片段不同拷贝数的pMD19-T(Simple)克隆质粒,以评价RAA检测方法的检测灵敏度;应用此方法检测多房棘球绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首鞭形线虫、贾第鞭毛虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫以及华支睾吸虫基因组DNA,以评价方法的特异性。方法优化后用于检测感染EgG1的动物组织标本(10份)、模拟现场阳性犬粪标本(3份)以及现场阳性犬粪标本(5份),以验证该项检测技术的可靠性和实用性。结果建立的RAA法可在40 min内特异性扩增EgG1的目的基因片段,最低可检测量为10 pg;以重组质粒为模板,RAA法最低检出质粒拷贝数为104个。用建立的RAA法检测其他寄生虫(包括多房棘球绦虫)结果均为阴性。用优化的RAA方法检测感染EgG1的动物组织标本以及阳性粪便标本(包括模拟现场粪便标本),结果均为阳性,且与PCR检测结果一致。结论建立的针对EgG1的RAA方法,其具有简便快捷、检测灵敏度与特异性均较好的特点,可望用于细粒棘球绦虫虫种的鉴定以及棘球蚴病基因诊断。