金龟子绿僵菌fluG基因的敲除及对产孢的影响

丝状真菌的fluG基因参与调控分生孢子的生成,然而在昆虫病原真菌金龟子绿僵菌中fluG的作用鲜有研究报道。本研究利用DNA同源重组方法,构建敲除fluG的金龟子绿僵菌突变株,分析突变株的产孢特性。以苯菌灵抗性基因ben作为筛选标记,fluG基因侧翼序列作为同源臂,构建了打靶载体pDHt/sk-fluG-Ben。利用PEG介导将打靶载体转化金龟子绿僵菌的原生质体,获得了苯菌灵抗性转化子。根据靶基因和标记基因检验,确定获得了敲除fluG的金龟子绿僵菌突变株。表型分析显示,fluG突变株继代培养5代仍保持苯菌灵抗性,菌落呈疏松毛絮状,生长相较野生型明显缓慢,不能或者仅能产生极少量分生孢子。说明fluG基因的敲除影响了菌株生长发育,并阻止了分生孢子形成,是金龟子绿僵菌产孢调节的重要基因。本研究为阐述金龟子绿僵菌产孢调控机制提供依据。

大肠杆菌合成2'-岩藻糖基乳糖基因组整合型菌株构建及发酵优化

2’-岩藻糖基乳糖(2’-Fucosyllactose,2’-FL)是一种岩藻糖化人乳低聚糖,具有预防肠道疾病、提高免疫力、促进大脑发育等重要生理功能。基于基因组水平,通过敲除大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中2’-FL合成前体物质相关代谢基因,如β-半乳糖苷酶基因(β-galactosidase,lac Z)、UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因(undecaprenyl-phosphate glucose-1-phosphate transferase,wca J)和GDP-甘露糖基水解酶基因(GDP-mannose mannosyl hydrolase,nud D),构建2’-FL合成底盘细胞;在此基础上,将外源α-1,2-岩藻糖基转移酶基因(α-1,2-Fucosyltransferase,wbg L)和磷酸甘露糖变位酶基因(phosphomannomutase,man B)、甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶基因(annose-1-phosphate guanylyltransferas,man C)、GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶基因(GDP-mannose 4,6-dehydratase,gmd)和GDP-岩藻糖合酶基因(GDP-L-fucose synthase,wca G)引入到大肠杆菌基因组中,探究在基因组水平过表达2’-FL合成基因对2’-FL产量的影响。结果表明,2’-FL在所构建菌株B-05的摇瓶含量达到了1.99 g·L^(-1)。进一步通过摇瓶发酵优化确定了最优发酵条件:IPTG诱导浓度为0.4 mmol·L^(-1)、诱导时OD600为2.4,诱导温度为28℃。在此条件下,摇瓶中2’-FL合成量达到了3.92 g·L^(-1)。最后在5 L发酵罐中,2’-FL含量达到了43.48 g·L^(-1)。研究表明通过将外源2’-FL相关合成基因导入基因组中进行过表达,实现了2’-FL高效合成,为构建整合型2’-FL菌株提供了数据支撑。

自杀质粒同源重组介导阴沟肠杆菌adh基因缺失突变体构建及其生物学特性

本研究旨在探究敲除阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)代谢通路上乙醇脱氢酶基因对乙偶姻代谢合成的影响,进一步提高乙偶姻产量。实验基于E.cloacae SDM中的乙醇脱氢酶adh基因序列设计特异性引物,并构建adh基因自杀质粒pKR6K-∆adh。利用热激法将自杀质粒转入E.cloacae∆budCldh,成功得到多基因缺失菌株E.cloaca∆budC-ldh-adh,并进行发酵性能测试。研究结果显示,与出发菌株相比,新构建的重组菌株在敲除了负责乙醇合成的关键酶乙醇脱氢酶adh基因后,其乙偶姻的生产强度提高了20.6%,产量提高了22.6%,同时乙醇产量提高了92.8%。此外,由于通过基因改造阻断了多条分支代谢路径,流向丁二酸代谢路径的碳通量明显变多,丁二酸产量提高101.3%。本研究成果不仅为构建高效乙偶姻生产菌株提供了有价值的参考,也为乙偶姻的大规模工业生产奠定了基础。

利用非同源末端连接缺陷构建拟轮枝镰孢菌的高效基因敲除方法

拟轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)是引起玉米茎基腐病和穗粒腐病的主要病原菌之一,严重威胁玉米的产量和品质。为了深入研究拟轮枝镰孢菌致病基因的功能,对该菌中非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)途径中的2个关键基因FvKu70和FvKu80分别进行了基因敲除以创制高效的基因敲除菌株,并比较了野生型菌株和突变体菌株在营养生长速率、菌落形态、产孢量、对玉米的致病力和基因敲除效率等方面的差异。研究结果表明,FvKu70和FvKu80的基因缺失突变体与野生型FvLNF15-11相比,在PDA平板上的形态特征(如菌丝形态、生长速率、菌落直径、产孢量)没有明显差异,对玉米茎秆的致病力也类似。此外,选择尿嘧啶生物合成相关基因FvpyrG作为敲除的靶基因,分析了FvKu70或FvKu80缺失突变体菌株的同源重组效率,结果显示突变体菌株均显著高于野生型,其中ΔFvKu70的同源重组效率最高。综上所述,FvKu70或FvKu80基因缺失突变体可以快速又高效地实现拟轮枝镰孢菌的基因敲除,为进一步研究该菌的功能基因提供了技术支持。

ptsG基因敲除对肺炎克雷伯氏菌CCR效应的缓解及发酵产2,3-BD的影响

旨在解决Klebsiella pneumoniae在利用混合碳源发酵生产2,3-丁二醇(2,3-butanediol,简称2,3-BD)时会产生碳分解代谢抑制(Carbon catabolite repression,CCR)效应,导致生产效率下降的问题。本研究以Cm抗性基因为标记,采用λRed同源重组技术成功构建ptsG基因缺失菌株K.pneumoniae HD79-N。此外,在利用葡萄糖与木糖混合碳源(葡萄糖:木糖=2:1)发酵的结果显示,K.pneumoniae HD79-N菌株由于敲除ptsG基因显著减弱了CCR效应,使其能够同步利用葡萄糖与木糖生产2,3-BD且最终产量达9.81±0.38 g/L。同时,K.pneumoniae HD79-N[0.23±0.01 g/(L·h)]菌株木糖利用率也比K.pneumoniae HD79[0.15±0.00 g/(L·h)]菌株提高了57.82%。本研究结果为缓解ptsG基因对K.pneumoniae菌株的CCR作用及提升2,3-BD的产量提供技术参考。

条件性敲除D1133L基因的重组非洲猪瘟病毒的构建及增殖特性

前期研究初步表明非洲猪瘟病毒(ASFV)编码的D1133L基因对ASFV复制至关重要,本研究拟进一步探究D1133L在ASFV复制中的作用。利用同源重组技术结合大肠杆菌lac阻遏操作系统实现条件性敲除D1133L基因,以pUC118为骨架重组转移载体ASFVΔi130,将重组转移载体转染骨髓源巨噬细胞(BMDMs),以ASFV CN/GS/2018为亲本毒株感染BMDM,在β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)存在的条件下,经绿色荧光和PCR鉴定,获得条件性敲除D1133L重组毒株vD1133Li。利用荧光显微镜观察该重组毒株与亲本毒株在猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中的复制差异,利用qPCR技术比较重组病毒与亲本毒株的复制差异,分析vD1133Li在无IPTG情况下回补D1133L蛋白后与在IPTG诱导情况下的复制差异。结果显示:本研究成功构建了条件性敲除D1133L的ASFV重组病毒vD1133Li,重组毒株不表达D1133L,在IPTG诱导下复制能力显著低于亲本毒株;在稳定表达D1133L的MA-104细胞系中,vD1133Li复制能力恢复。综上所述,D1133L基因对于ASFV复制至关重要,试验结果为进一步研究D1133L在ASFV致病中的机制及针对D1133L靶向药物研发提供了研究基础。

atpA基因缺失对貉源大肠杆菌生物学特性的影响

为研究编码ATP合酶α亚基对大肠杆菌生物学特性的影响,本研究利用λ-Red同源重组技术构建貉源致病性大肠杆菌LCE-1(WT)atpA基因缺失菌株LCE-1ΔatpA(KO)和基因回补株LCE-1ΔatpA/pBR322-atpA(RS),并均采用PCR和测序鉴定。在此基础上,进一步分析atpA基因缺失对大肠杆菌的生长特性、生化特性的影响,结果显示,在LB培养基中KO菌株与WT菌株相比生长无明显差异,但在M9培养基中生长明显减缓;KO菌株的部分生化特性也发生了变化,对蔗糖、肌醇的分解利用发生改变,α-葡萄糖苷酶、β葡萄糖醛酸酶、精氨酸双水解酶活性也发生了改变。通过试管及微量结晶紫法分析3株菌生物被膜(BF)的形成能力,结果显示atp基因缺失能够显著降低大肠杆菌BF的形成能力(P<0.01)。对这3株菌进行酸应激、碱应激、热应激以及氧化应激测定这3种菌株对环境变化的应激能力,结果显示atp基因缺失能够显著提高大肠杆菌对酸应激、碱应激、热应激和氧化应激的敏感性。通过K-B纸片法对这3株菌的耐药性进行测定,结果显示KO菌株对多种抗生素的敏感性有所增强。利用KO、WT菌株分别感染小鼠进行致病性试验,结果显示,WT菌株的LD50为4.12×10^(7) cfu/mL,KO菌株的LD50为3.43×10^(8) cfu/mL,KO菌株毒力下降1个数量级。本研究构建了大肠杆菌的atpA基因缺失株,并证实AtpA蛋白在细菌的生化特性以及应对各种应激过程中具有重要作用,是大肠杆菌一个重要的多功能蛋白。

巨噬细胞条件性GP73基因敲除小鼠的构建及鉴定

目的构建并鉴定巨噬细胞条件性高尔基体蛋白73(golgi protein 73,GP73)基因敲除小鼠,为进一步研究GP73调控巨噬细胞功能影响肿瘤性疾病的发生发展提供动物模型。方法基于Cre/LoxP重组系统构建GP73^(flox/+)小鼠,通过GP73^(flox/+)小鼠雌雄自交得到GP73flox/flox小鼠。将GP73flox/flox小鼠与Lyz2⁃Cre+小鼠杂交,得到GP73flox/+Lyz2⁃Cre+小鼠,再将其与GP73flox/flox小鼠杂交,最终得到基因型为GP73flox/floxLyz2⁃Cre+的巨噬细胞条件性GP73基因敲除小鼠(MKO小鼠);以GP73flox/floxLyz2⁃Cre-小鼠作为对照组小鼠(GP73^(fl/fl)小鼠)。采用PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠flox及Cre基因型。采用实时荧光定量PCR(qPCR)及蛋白免疫印迹(Western blot)分别从mRNA水平和蛋白水平验证小鼠巨噬细胞GP73敲除效果及组织特异性。计算小鼠各组织质量与体重的比值以分析小鼠的生长发育情况,并检测小鼠血生化指标。结果通过基因鉴定、mRNA水平及蛋白水平证实巨噬细胞条件性GP73基因敲除小鼠构建成功。qPCR检测显示,与GP73^(fl/fl)小鼠相比,MKO小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow⁃derived macrophages,BMDMs)和腹腔原位巨噬细胞(peritoneal macrophages,PM)中GP73 mRNA水平均降低(P<0.0001);Western blot检测结果显示,GP73蛋白在MKO小鼠BMDMs和PM中的表达水平均较GP73^(fl/fl)小鼠明显降低,但在肝脏、肾脏及胸腺组织中GP73蛋白表达水平无显著差异。与GP73^(fl/fl)小鼠相比,MKO小鼠心、肝、脾、肺、肾、棕色脂肪及白色脂肪组织重量与体重之比无差异,各组织无形态学差异。血生化检测结果显示,MKO小鼠与GP73^(fl/fl)小鼠的各项血生化指标差异均无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建巨噬细胞条件性GP73基因敲除小鼠模型,为深入研究GP73调控巨噬细胞功能在肿瘤性疾病中的作用和机制提供良好的动物模型。

橙色红曲菌Ku70基因缺失菌株的构建及功能分析

红曲菌作为传统的药食同源微生物,可产生多种有益的代谢产物,如:红曲色素、洛伐他汀、γ-氨基丁酸等。构建基因工程菌是研究红曲菌代谢途径的有效方法,同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)被认为是丝状真菌DNA双链断裂(DSB)修复的两种主要途径。有研究表明,抑制NHEJ中关键成分的活性通常会提高目的基因的同源重组效率。我们在橙色红曲菌(Monascus aurantiacus)AS3.4384中发现了参与NHEJ途径的Ku70蛋白。通过农杆菌介导的同源重组法成功敲除Ku70基因,发现不影响红曲菌的生长繁殖\\产孢能力以及色素的生物合成,因此可构建Ku70基因缺失菌株作为红曲菌高效基因敲除体系,为后续的基因敲除提供研究材料。

多重耐药维氏气单胞菌porin基因敲除的构建及其耐药特性研究

目的研究微孔蛋白基因porin对维氏气单胞菌(Aeromonas veronii,A.veronii)耐药性的影响以解析A.veronii的耐药机制。方法以多重耐药的A.veronii WL-3为研究对象,采用同源重组双交换的方法构建Δporin敲除株,利用比浊法测定其生长曲线,通过药敏纸片法分析其耐药性。结果以A.veronii WL-3基因组DNA为模板,利用overlap聚合酶链式反应技术扩增获得上下同源臂融合片段,并连接至自杀质粒pDM4中,重组成敲除质粒pDM4-Δporin。将pDM4-Δporin转化至感受态大肠杆菌SM10中,通过接合转移转入A.veronii WL-3中。通过同源重组双交换构建A.veronii WL-3Δporin敲除株。生长曲线显示与野生株相比,Δporin菌株的生长速度并无明显变化;抗生素耐药特征分析显示敲除porin基因会降低A.veronii对头孢氨苄、新霉素、四环素、环丙沙星等10种抗生素的敏感性,提高对多粘菌素B的敏感性。结论基因porin不是A.veronii生长所必需的,但会影响A.veronii对部分抗生素的敏感度。本研究所构建的敲除株可为深入研究porin在A.veronii的耐药机制提供必要材料。

OBSCN突变对于肝癌细胞增殖和迁移能力的影响

目的构建细胞骨架蛋白OBSCN基因过表达和敲除的稳转细胞系,初步探究OBSCN突变对肝癌细胞增殖和迁移能力的影响。方法qPCR技术确定HepG2肝癌细胞有无OBSCN本底表达,慢病毒感染HepG2细胞构建过表达细胞系;Crispr cas9技术构建敲除细胞系;并利用Western blot技术检测敲除及过表达细胞Obscurin蛋白表达量,CCK-8法和Transwell小室法探究OBSCN突变细胞株的增殖和迁移能力。结果qPCR验证HepG2细胞无OBSCN本底表达,慢病毒感染得到HepG2 H21157过表达稳转细胞系和HepG2 GL119对照空载体稳转细胞系;菌落PCR、质粒PCR以及基因测序结果验证敲除重组质粒reOBSCN构建成功,转染得到OBSCN敲除的HepG2 OBSCN KO稳转细胞系和对照空载体HepG2 ecas稳转细胞系;Western blot技术验证OBSCN敲除及过表达细胞系构建成功;CCK-8法结果显示OBSCN过表达加快了HepG2细胞增殖,差异有统计学意义(P<0.0001),OBSCN基因的敲除可以减慢HepG2细胞增殖,差异有统计学意义(P<0.0001);Transwell小室法得到HepG2 H21157、HepG2 GL119的迁移细胞数分别为150.30±14.95、136.50±15.02,HepG2 OBSCN KO、HepG2 ecas的迁移细胞数分别为112.70±20.30、147.8±11.55,差异有统计学意义(P<0.01)。结论OBSCN基因的过表达会加快HepG2肝癌细胞的增殖和迁移,OBSCN基因的敲除会减慢HepG2肝癌细胞的增殖和迁移。

农杆菌介导的基因敲除技术在丝状真菌基因功能研究中的应用

近年来不少丝状真菌全基因组测序已经完成或正在进行,基因功能研究已成为真菌研究的一个热点。利用反向遗传学的方法敲除基因是研究丝状真菌功能基因的常用方法之一,基因敲除是通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组,可以敲除整个基因,或者将一个基因替换成该基因的等位基因,或者用一个调控启动子替换一个基因正常的启动子,从而精细地定点修饰和改造基因DNA片段的技术。本文简述了利用农杆菌介导的遗传转化方法(ATMT)进行基因敲除的技术在丝状真菌基因组功能研究中的应用。

基因敲除技术及其在微生物代谢工程方面的应用

应用基因工程技术对微生物细胞内的代谢通量进行重新设计,是获得高产高效的工业菌株的重要手段之一。基因敲除是20世纪80年代发展起来的一项重要的分子生物学技术,利用基因敲除技术可阻断细胞的代谢旁路,或通过引入突变位点改变目的产物的产量或质量而达到调节代谢流,优化代谢途径的目的。简单介绍了基因敲除技术的操作过程,重点讨论基因敲除技术的敲除策略及在微生物代谢工程方面的应用,并展望了相关技术在诸多领域的发展趋势。

副溶血性弧菌基因敲除方法的建立及应用

目的摸索出一套副溶血性弧菌基因敲除的可靠方案,副溶血性弧菌致病相关基因的敲除对深入研究其致病机制有重要意义。方法通过融合PCR技术将目的基因上下游同源臂融合并克隆到自杀载体pDS132上,将重组质粒转化大肠杆菌S17λpir中,再接合转移到副溶血性弧菌菌株内,经pDS132质粒上sacB基因的反向筛选得到突变株。结果成功构建了副溶血性弧菌RIMD2210633菌株ΔopaR,ΔtoxR和ΔaphA三个基因突变株。结论通过自杀载体同源重组成功获得精确敲除的无痕突变株更有利于基因功能的研究,使后续副溶血性弧菌突变株与野生株的对比研究成为可能。

产琥珀酸大肠杆菌工程菌株的构建

大肠杆菌在厌氧条件及不额外添加电子受体的条件下可利用葡萄糖进行混合酸发酵,主要产物为甲酸、乙酸和乙醇,丁二酸及乳酸含量较低。为减少副产物的生成,使更多的代谢流流向丁二酸,本研究拟失活厌氧条件下甲酸、乙酸及乳酸主要生成途径相关的酶(乳酸脱氢酶和丙酮酸甲酸裂解酶)。借助Red重组系统和位点特异性重组技术,无痕敲除了野生大肠杆菌W3110染色体上编码2个酶的基因pfl和ldh,构建了1株pfl和ldh双突变重组菌JM130(7△pfl△ldh),并引入PYC前后对比实验表明:JM1307(pTrc99a-pyc)较出发菌株解除了生长抑制,在8g/L初糖条件下,发酵48h,菌体密度可提高至OD6002.5,产物主要为丁二酸(2.8g/L),乙酸含量很低,无甲酸、乳酸生成。

基因敲除在工业微生物育种方面的应用

微生物育种技术的发展先后经历了自然选育、诱变育种、杂交育种、代谢控制育种和基因工程育种5个阶段,其中基因工程育种技术中的基因敲除技术具有定位性强、经修饰和改造的基因能够随染色体DNA的复制而稳定地复制的特点,使人们可以有目的地去改造生物的遗传物质,从而达到微生物育种的目的,受到人们的广泛关注。就基因敲除技术的几种主要方法及其在改良工业生产菌株中的应用作简要介绍。

Cre-LoxP系统在炭疽芽胞杆菌基因敲除中的应用及eag基因的敲除

将Cre-LoxP系统应用于Bacillus anthracis中并成功敲除eag基因.以B.anthracis基因组为模板扩增得到上下游同源臂,联合两端带有LoxP位点的壮观霉素抗性基因片段构建好同源重组载体,转化B.anthracisAP422,通过一系列筛选得到带有抗性标记的重组菌.然后,通过转入Cre重组酶表达质粒,去除抗性标记,得到eag基因缺失的重组菌,并在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行了系统的鉴定.最终建立了Cre-LoxP系统在B.anthracis中的应用方法,并成功敲除eag基因.

用Red/ET重组酶构建基因打靶载体

基因敲除的小鼠模型是研究基因功能的一种重要资源。采用常规分子克隆的方法建立基因敲除的打靶载体存在构建效率低和难以获得长片段同源臂的缺点。因此快速高效地构建打靶载体,已成为获得特定基因敲除动物模型的关键环节。为研究Resp18未知功能分泌肽基因,应用一种新的DNA工程平台——Red/ET同源重组技术来构建其打靶载体,并比较了这一方法在构建不同长度同源臂中的效率。研究表明,Red/ET重组方法构建打靶载体具有很高的效率,可以获得较长的同源臂,并且不会引入突变,有助于获得更高的打靶效率。因此Red/ET重组为构建打靶载体提供了一种新的可靠的方法。

同源重组敲除三角褐指藻基因的研究

为探索应用基因敲除技术研究三角褐指藻基因功能的研究体系,本文以三角褐指藻甘油激酶基因作为靶基因,构建了同源重组基因敲除载体,利用微弹轰击法将该载体成功转化至三角褐指藻中,经100μg/mL Zeocin筛选和PCR验证获得了34个阳性转基因藻株;并进一步对三角褐指藻甘油激酶基因敲除转基因藻株的甘油激酶表达量和生长两方面进行分析,结果显示胞外甘油兼养不影响转基因藻细胞生长,甘油激酶不表达或表达量降低.本文通过构建敲除载体,完成了遗传转化,筛选获得阳性转基因藻,并进一步研究了转基因藻的性状,最终建立了应用同源重组基因敲除技术靶向研究三角褐指藻基因功能的研究体系.

假单胞菌基因敲除方法研究进展

基因敲除是近年来十分热门的基因工程技术,假单胞菌(Pseudomonas)作为一种常见细菌,应用十分广泛,因此,对假单胞菌进行基因敲除改造有着十分重要的意义。总结了假单胞菌基因敲除技术成功案例,并对2种基因敲除系统进行了比较,包括同源重组关键步骤的转化方式、基因敲除方法的选择、同源臂长度的选择等。