Identification of quantitative trait loci for growth traits in red swamp crayfish(Procambarus clarkii)

Genetic breeding is an important approach to improve the economic traits of aquaculture animals.Unfortunately,the genetic basis for important economic traits of red swamp crayfish,including growth-related traits,has not yet been reported.In the present study,two full-sib families and two natural populations were employed to identify quantitative trait loci(QTLs)for growth-related traits of red swamp crayfish.In total,28 QTLs for five growth-related traits,including body weight,body length,carapace length,carapace width,and abdomen length,were repeatedly identified in more than two families/populations,by means of association analysis;nine of these displayed a heterosis effect.The phenotypic variations of the five investigated traits explained by the 28 QTLs ranged from 4.2%to 19.0%.Eight additive and three heterosis QTLs were further successfully validated using comparative analysis of favoured alleles between the small and big size crayfish groups in the natural population.In conclusion,this study investigated the genetic basis of growth-related traits in red swamp crayfish,which is of great significance for their application in the future molecular breeding of the species.

大豆球蛋白对克氏原螯虾肠道菌群和抗菌相关基因的影响

实验旨在探究不同水平的大豆球蛋白对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)肠道菌群和抗菌相关基因的影响。在饲料中添加0 (G0组,作为对照组)、1.82%(GL组)、3.64%(GH1组)、5.46%(GH2组)和7.28%(GH3组)五种不同水平的大豆球蛋白饲喂克氏原螯虾(平均体重约为4.3 g) 4周。养殖实验结束后测定肠道微生物的组成和抗菌相关基因的表达。结果显示:(1)饲料中的大豆球蛋白对克氏原螯虾肠道菌群的Alpha多样性没有显著性影响,但改变了其肠道菌群组成。GL组Cloacibacterium、沙曼气单胞菌(Aeromonas sharmana)等菌群的相对丰度显著高于其他4组。与G0组相比,红杆菌属(Rhodobacter)、副球菌属(Paracoccus)、丙酸杆菌属(Propionicimonas)和生丝微菌属(Hyphomicrobium)等益生菌及亨氏柄杆菌(Caulobacter henricii)的相对丰度在GH2或GH3组中显著下降;而GH3组壤霉菌属(Agromyces)、巴氏微杆菌(Microbacterium barkeri)、假黄色单胞菌属(Pseudoxanthomonas)和军团杆菌属(Legionella)等潜在病原菌的相对丰度显著高于G0组。(2)随着大豆球蛋白水平的升高,各组肠道抗菌相关基因的表达水平呈现一次线性和二次响应的变化趋势。与G0组相比,GL组抗脂多糖因子(alf)、甲壳素(cru)和血蓝蛋白(hem)基因的表达水平显著下降;除组织蛋白酶-B (cst-b)外,GH1、GH2和GH3组其他抗菌相关基因的表达水平随着饲料中大豆球蛋白水平的升高而显著上升;GH2组cst-b的表达水平显著高于其余4组。(3)斯皮尔曼相关分析结果表明肠道菌群和抗菌相关基因之间存在显著的相关关系。cru、alf、C型凝集素(lec-c)、溶菌酶(lys)、白细胞介素增强因子结合子-2 (iebf-2)、hem、热休克蛋白-70 (hsp-70)和cst-b的表达水平与亨氏柄杆菌、副球菌属、红杆菌属、丙酸杆菌属、Desulfovibrio putealis、Thermomonas dokdonensis、沙曼气单胞菌和气单胞菌属、Chitinilyticum aquatile、台湾几丁质杆菌、Cloacibacterium和生丝微菌属等菌群的相对丰度具有显著的负相关关系;而与壤霉菌属、产气荚膜梭杆菌(Clostridium Perfringens)、巴氏微杆菌、乳球菌(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)和Peredibacter starrii等菌群的相对丰度具有显著的正相关关系。综上所述,饲料中低水平的大豆球蛋白(1.82%)在一定程度上能够促进肠道中益生菌的生长,改善肠道菌群健康,同时下调抗菌相关基因的表达;而高水平的大豆球蛋白(≥3.64%)可能抑制了益生菌的生长,导致病原菌的增殖,从而破坏了肠道菌群稳态,并且上调了抗菌相关基因的表达。相关分析结果表明抗菌相关基因与肠道菌群之间可能存在一定的互作关系。

淡水小龙虾主要过敏原原肌球蛋白基因的克隆、表达及其免疫活性鉴定

目的:克隆、表达淡水小龙虾肌肉中主要过敏原原肌球蛋白(tropomyosin),并对其免疫活性进行鉴定。方法:根据甲壳类的泛过敏原tropomyosin基因的高度保守性设计简并引物,通过RT-PCR克隆出淡水小龙虾虾肉中过敏原tropomyosin的全长基因。将该基因与pET-28a载体连接并转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经诱导异丙基-B-D-硫代乳糖苷(IPTG)诱导表达,Ni2+亲和层析柱纯化后,用Western blot检测该重组蛋白的免疫活性。结果:序列分析显示该基因包括一个编码284个氨基酸的开放阅读框,与已知虾、蟹、龙虾等的过敏原tropomyosin基因有较高同源性(>80%)。根据过敏原的命名规则,将其命名为Proc 1,并提交GenBank数据库,登录号为FJ769183。重组小龙虾tropomyosin在大肠杆菌中能高效的表达,Western blot检测结果显示该重组蛋白具有良好的免疫活性。结论:研究成功表达了具有免疫活性的淡水小龙虾原肌球蛋白,为虾过敏性疾病的诊断和治疗奠定了基础。

克氏原螯虾暴发性疾病病原及其传播途径的初步研究

为了探讨克氏原螯虾(Procambarus clarkii)暴发性疾病的传染途径和致病病原,取呈现暴发性疾病典型症状的克氏原螯虾的组织与内脏,制作成螯虾肉糜后分为3份,分别采用抗生素除菌、不做任何处理和在100℃水浴锅中保持1 h等3种方法将螯虾肉糜处理后,连续投喂体重(5.6±0.3)g的幼年虾、体重(17.5±0.4)g的青年虾和体重(24.6±0.5)g的成年虾7 d后,继续饲养观察28 d,比较了各试验组螯虾的死亡率。结果表明,口服经过抗生素除菌和未经任何处理的患病螯虾组织能导致健康试验螯虾发病而死亡,而且青年虾和成年虾死亡数量较幼年虾多;与加热处理患病螯虾组织相比,未经处理的患病螯虾组织诱导健康克氏原螯虾发病率最高,抗生素处理组其次,这种结果预示着患病螯虾组织中存在能导致克氏原螯虾疾病发生的致病性病毒和细菌,而且健康的克氏原螯虾可以通过摄食带病原的患病虾受感染。采用盐酸多西环素对患病虾的治疗未显示出疗效。

嗜水气单胞菌对克氏原螯虾免疫相关因子活性的影响

将嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）用灭菌生理盐水调节至1．5×10^4cfu／mL（I组）和1．5×10^5cfu／mL（Ⅱ组）的浓度后，注射法接种克氏原螯虾（Procambarus clarkii）（人工感染），定时检测供试克氏原螯虾的总血细胞数量（THCs）、淋巴液中酚氧化酶（PO）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶活性和抗茵活力等免疫相关因子活性的变化状况。结果表明，注射不同浓度的A．hydrophila后的8～48h之间，供试克氏原螯虾的免疫相关因子的活性发生了显著变化。2个试验组的克氏原螯虾在注射A．hydrophila后8～48h内，THCs和SOD活性显著低于注射生理盐水的对照组，其中I组克氏原螯虾的THCs和SOD活性分别于注射感染的12、24h降至最低值，于48、96h恢复至正常值；而Ⅱ组克氏原螯虾的THCs和SOD活性均于48h降至最低值，于96h逐渐恢复。I组克氏原螯虾在注射A．hydrophila后12-48h，溶菌活力、抗菌活力和PO活性均显著高于对照组，并分别于24、24、48h达到最大值，96h后恢复正常；而Ⅱ组克氏原螯虾在注射A．hydrophila后12-48h，溶菌活力、抗菌活力和PO活性均显著低于对照组，均于48h降至最低，96h后逐渐恢复接近正常值，但是仍然低于对照组。

盐酸土霉素对人工致病克氏原螯虾的治疗效果研究

用口服患病克氏原螯虾(Procamgbarus clarkii)组织、注射拟态弧菌(Vibrio mimicus)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的方法,人工感染健康克氏原螯虾致病后,定时投喂盐酸土霉素药物饵料,观察了药物饵料对人工致病克氏原螯虾的治疗效果。结果表明,投喂含有盐酸土霉素的药物饵料对人工注射V.mimicus和V.parahaemolyticus致病的克氏原螯虾有比较好的治疗效果,而对口服患病克氏原螯虾组织致病的克氏原螯虾的治疗效果比较差。但是,与口服患病克氏原螯虾组织致病后未用药物饵料治疗的对照组相比,投喂药物饵料对克氏原螯虾疾病发展有一定的控制作用。推测克氏原螯虾暴发性疾病的致病原因主要是由于致病病毒引起,而致病菌在克氏原螯虾体内的存在,可能导致混合感染而死亡率上升。

克氏原螯虾精子竞争研究

克氏原螯虾雌性一生中与不同雄性交配多次,其特殊器官纳精可长时间储存精子,具备精子竞争产生的条件。利用不同群体克氏原螯虾的种间交配,对其精子竞争现象进行探讨。试验虾[质量(35.2±5.3)g]在水族箱(40cm×20cm×50cm)中雌雄分开暂养,保持水族箱中溶氧5mg/L,水温27℃,日换水1/2。采用单对交配的方法,待雌虾与一尾雄虾(♂1)交配成功后,再与另一尾雄虾(♂2)进行交配,最后培养雌虾至幼体孵化。采用扩增片段长度多态性分子标记技术对幼体及亲本之间的亲缘关系进行研究,6组试验中有4组出现了特殊性条带(雄1特有或雄2特有),其中有3组的P2值均超过70%,平均为(75.19±1.80)%。试验结果表明,克氏原螯虾存在精子竞争现象,且最后交配雄虾精子优先受精。该现象的产生与克氏原螯虾长时间抱对和长时间储存精子有一定关系,精子竞争的发生对克氏原螯虾的遗传多样性有一定影响。

提取甲壳素的乳酸菌发酵工艺优化

以地产克氏螯虾(Procambarus clarkii)虾壳为原料,采用乳酸菌(Lactococcus lactis)发酵的方法提取甲壳素,并对发酵工艺进行优化研究。结果表明,发酵的最佳工艺组合为发酵温度37℃,发酵时间96 h,葡萄糖加入量5%,固液比1.0∶3.0(m/V,g∶mL),发酵起始pH 5.5。采用上述组合,所得甲壳素产率达13.9%。该工艺具有显著的经济效益和社会效益,具有良好的应用前景。

克氏原螯虾体征性状与肌肉质量的相关及通径分析

含肉率是克氏原螯虾的重要经济性状之一,与肌肉质量呈正相关。为鉴定与肌肉质量相关的体征性状,收集904尾野生克氏原螯虾(397尾雄性、507尾雌性),并根据体质量分别将雄、雌个体分成10、15、20、25、30、35、40、45g8个不同规格的群体。对各规格克氏原螯虾的螯质量、螯长、体质量、体长、肌肉质量(腹部肌肉)、含肉率(肌肉质量占体质量百分比)、头胸甲长与头胸甲宽性状进行测定。统计分析发现,除含肉率外的6个性状数值均随体质量增加而增加。同等规格的雌性个体的体长、肌肉质量与含肉率均极显著大于雄性;相反,雄性个体的螯长与螯质量极显著大于雌性。相关分析结果显示,在中等规格(25~35g)和大规格(40~45g)群体中,螯质量与含肉率呈极显著负相关。多元逐步回归分析与通径分析结果显示,螯质量与体质量分别对肌肉质量具有负向和正向直接作用。综上可知,降低螯质量是提高克氏原螯虾含肉率的重要育种策略。

壳聚糖对克氏原螯虾抗低温应激的影响

采用单因子试验设计方法,以克氏原螯虾(Procambarus clarkii)为研究对象,将试验分成阴性对照组、阳性对照组和3个试验组共5组,阴性对照组投喂基础饲料,饲养试验结束后不进行低温应激处理;阳性对照组投喂基础饲料,饲养试验结束后与试验组一起进行低温应激处理;3个试验组分别投喂在基础饲料中添加0.50%、1.00%、1.50%壳聚糖的试验饲料,室温下饲养2个月后测定克氏原螯虾血清中的葡萄糖含量、过氧化氢酶(CAT)和碱性磷酸酶(AKP)活力,旨在探讨壳聚糖对克氏原螯虾抗低温应激的影响。结果表明,与阳性对照组相比,饲料中添加适量的壳聚糖均能降低处于低温应激下克氏原螯虾体内的血糖含量,提高血清中CAT和AKP活力,其中1.00%壳聚糖组血糖含量降低的幅度最大,0.50%壳聚糖组和1.00%壳聚糖组血清中CAT活力提高的幅度最大;0.50%壳聚糖组血清中AKP活力提高的幅度最大;但均未达到无应激水平。由此看来,在克氏原螯虾饲料中添加0.50%～1.00%的壳聚糖可以在一定程度上起到抵抗低温应激的作用。

长江中下游流域13个克氏原螯虾群体遗传多样性和遗传结构分析

用8个SSR(simple sequence repeats)分子标记分别对我国长江中下游流域的13个克氏原螯虾野生群体的等位基因数(Na)、期望杂合度(He)、观测杂合度(Ho)、多态性信息含量(PIC)、Hardy-Weinberg平衡指数与遗传距离等进行研究。结果显示:各群体不同标记位点的等位基因数为3~5个,平均期望杂合度、平均观测杂合度与多态性信息含量分别分布在0.37~0.57、0.23~0.48与0.40~0.56,表明在这些群体中存在较丰富的遗传多样性。群体遗传距离聚类分析得出:13个克氏原螯虾群体初步分化为3个类群,分别为以太湖(TH)与鄱阳湖(PYH)为代表的类群,以重庆与巢湖为代表的类群和以洪湖、洞庭湖与洪泽湖等为代表的类群。以上结果表明我国具有遗传多样的克氏原螯虾种质资源。

不同饲养状态下克氏原螯虾的格斗行为

为探究不同饲养状态下克氏原螯虾的格斗行为,丰富克氏原螯虾的行为学研究内容,进行2期试验。第1期试验取50尾隔离组克氏原螯虾投入非隔离组驯养箱内(单—群组),取50尾非隔离组克氏原螯虾投入非隔离组的其他驯养箱内(群—群组),24h后记录各箱内克氏原螯虾存活数。第2期试验取隔离组和非隔离组中体质量和体长接近的同性克氏原螯虾两两组内配对(非隔离组克氏原螯虾不与原同伴配对),形成36对格斗,用摄像头拍摄格斗过程,记录克氏原螯虾间第一次格斗起始时间(犹豫期时长)、每次格斗时长、总格斗时长和格斗回合数。以总格斗时长和格斗回合数的比值,即平均每次格斗时长作为格斗强度的衡量标准。结果表明,单—群组死亡率显著高于群—群组(P<0.05);隔离状态下饲养的克氏原螯虾之间的格斗发生率、格斗回合数、格斗总时长以及格斗强度均显著大于非隔离状态下饲养的克氏原螯虾(P<0.05);但剔除未格斗样本后,两种饲养状态下的克氏原螯虾各项格斗行为参数均无显著差异(P>0.05)。本试验结果揭示了隔离环境下饲养的克氏原螯虾更加好斗,但隔离环境并不提升克氏原螯虾的战斗能力。当某一克氏原螯虾从隔离环境进入陌生群体环境时,更容易发生死亡现象(入侵者死亡,或原住民死亡,或两者先后发生死亡)。

养殖塘和市售小龙虾肠道细菌多样性的比较

养殖塘与市售小龙虾在摄食、存活率方面存在明显差异。为了揭示这些差异是否与肠道细菌群落组成有关,通过Illumina高通量测序技术研究了养殖塘和市售小龙虾肠道细菌群落组成,并对群落功能进行了分析。结果显示,养殖塘小龙虾肠道细菌群落组成与市售小龙虾差异明显。养殖塘小龙虾肠道细菌优势门为变形菌门(Proteobacteria)(占49.98%~58.11%)、厚壁菌门(Firmcutes)(9.51%~36.76%)、软壁菌门(Tenericutes)(6.02%~26.96%)和拟杆菌门(Bacteroidetes)(4.06%~4.14%);市售小龙虾肠道细菌主要优势门为拟杆菌门(21.05%~39.22%)、厚壁菌门(20.51%~35.94%)、暂定门RsaHF231(11.55%~46.34%)和变形菌门(4.29%~11.04%)。在属水平上,柠檬酸杆菌属和哈夫尼菌属是养殖塘小龙虾肠道中的正常核心菌群,但其在市售样本中占比较低;暂定门RsaHF231未分类属、拟杆菌属、丹毒丝菌科的[Anaerorhabdus]_furcosa_group和g_ZOR0006是市售小龙虾肠道中的优势类群,但在养殖塘样本中含量较低。COG功能预测结果显示,养殖塘小龙虾肠道细菌群落的代谢功能较市场样本旺盛。与养殖塘小龙虾相比,市售小龙虾肠道细菌群落组成和功能有较大差异,这可能与其摄食减少、存活率降低有关。

稻太郎和稻黄金对克氏原螯虾急性毒性及安全性评价

在22~23℃水温下,以无药物添加为对照,在十格的聚乙烯箱子内采用静水毒理试验法研究了稻太郎和稻黄金两种除草剂对体质量(3.66±0.15)g的克氏原螯虾Procambarus clarkii的急性毒性。结果表明:稻太郎和稻黄金对克氏原螯虾的24h半致死浓度分别为542.9 mg/L、1795.7mg/L;48h LC50分别为369.9 mg/L、1646.1mg/L;72h LC50分别216.5 mg/L、1511.3mg/L;96hLC50分别216.5mg/L、1352.9mg/L;安全浓度分别为51.5mg/L和414.4mg/L,即稻太郎对克氏原螯虾的毒性大于稻黄金。根据本文数据和相应国家标准,稻太郎和稻黄金两种除草剂的正常施药浓度远低于安全浓度,可以在稻虾田中安全施用。

切除眼柄对加速克氏原螯虾卵巢发育进程的组织学研究

应用组织切片和透射电镜技术研究眼柄切除对加速克氏原螯虾(Procambarus clarkii)卵巢发育进程的影响。实验分成4组,选取眼柄切除15 d和30 d两个时间点进行。切除眼柄30 d后,雌虾体长增长显著,从(11.50±2.30)cm增长至(18.20±3.40)cm(P<0.05),性腺指数(GSI)从4.56%±2.81%增长至8.05%±2.51%(P<0.05),体重和螯肢长也有所增长(P>0.05)。电镜观察发现卵母细胞从发育Ⅱ期迅速度过Ⅲ期进入到Ⅵ期阶段,卵母细胞体积变大,变圆;液泡压缩变小;卵黄颗粒加速积累,逐渐占满整个胞内空间;滤泡细胞胞质从黏稠变稀薄。这些结果表明,切除眼柄在短期内显著加快卵母细胞内卵黄颗粒的积累,并且加快个体生长。

小龙虾肠道细菌群落多样性及产蛋白酶细菌的筛选

【背景】养殖动物对饲料的消化利用往往与肠道菌群密切相关。【目的】揭示小龙虾肠道细菌群落组成,并从小龙虾肠道筛选产蛋白酶细菌。【方法】在Illumina MiSeq PE300平台对细菌16S rRNA基因V3-V4区进行高通量测序,分析小龙虾肠道细菌群落多样性;通过酪蛋白平板法筛选产蛋白酶细菌并进行分子生物学鉴定。【结果】小龙虾肠道细菌优势门包括变形菌门、软壁菌门、厚壁菌门、拟杆菌门等4个门,累计占比为98.53%;优势属包括柠檬酸杆菌属、支原体科CandidatusBacilloplasma暂定属、哈夫尼菌属、肠球菌属、拟杆菌属、梭菌科未分类属、希瓦氏菌属等7个属,累计占比为91.67%。通过酪蛋白平板法筛选的产蛋白酶细菌来自哈夫尼菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和芽孢杆菌属。【结论】小龙虾肠道细菌核心类群在蛋白质消化利用中发挥了重要作用。