英国红芸豆抗氧化肽对氧化应激斑马鱼的保护作用研究

为探究英国红芸豆抗氧化肽组分(BRKBPAPC)的体内抗氧化作用,利用2,2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐诱导建立氧化应激斑马鱼模型,研究BRKBPAPC对氧化应激斑马鱼的影响。结果表明:BRKBPAPC能显著提高(P<0.05)斑马鱼体内过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力和总抗氧化能力(T-AOC),显著降低(P<0.05)丙二醛(MDA)含量;同时BRKBPAPC还具有调节斑马鱼脂代谢的能力,随着处理浓度的增加斑马鱼脂代谢指标逐渐恢复正常水平;高剂量BRKBPAPC可使斑马鱼行为轨迹增多,高速运动次数、时间、距离显著上升。高剂量抗氧化肽处理21 d时,CAT、SOD、T-AOC、GSH-Px分别增至(28.29±3.29)、(126.59±6.39)、(2.07±0.18)、(84.75±7.77)U/mg prot,MDA含量降至(3.35±0.29)nmol/mg prot。由此可见,BRKBPAPC具有较好的体内抗氧化作用及脂代谢调节能力。

斑马鱼快速骨质疏松模型方法的建立与优化

目的本文通过比较常见斑马鱼骨质疏松(osteoporosis,OP)模型不同建立方法,优化建立一种快速、稳定、灵敏的造模方法。方法采用铁过载及泼尼松龙(prednisolone,Pred)诱导OP模型,观察骨形成情况及动物死亡率,分组为:空白对照组(Control组)、模型组(包括FAC组和Pred组)、阳性对照组(AC组)。铁过载诱导法采用枸橼酸铁铵(ammonium ferric citrate,FAC)为造模药物。Pred诱导法有Pred-3受精后天数(day post fertilization,dpf)法,造模时间为3~9 dpf;Pred-5 dpf法,造模时间为5~10 dpf;Pred撤药法,3 dpf开始造模,7~9 dpf每天撤去1/3造模药物。进而比较常用药物阿尔法骨化醇(alfacalcidol,AC)、骨化三醇(calcitriol,CA)、阿仑膦酸钠(alendronate,AL)抗OP效应,选择稳定、灵敏的阳性药,并进一步对不同染色方法及染色条件进行优化。结果FAC在500μg/mL剂量下未能观察到对骨形成的显著影响。骨节数及第一椎骨长度结果显示,与Control组比较,Pred-3 dpf诱导法Pred组均降低,具有显著性差异(P<0.01,P<0.05),但斑马鱼死亡率较高;Pred-5 dpf法无显著性差异;Pred撤药法Pred组均降低,具有显著性差异(P<0.01),且无死亡。给予AC、CA、AL后均具有抗OP作用,CA抗OP作用更为灵敏、稳定。茜素红(alizarin red,ARS)染色参数优化结果显示,染色浓度为0.02%,染色2 h,0.5%KOH和甘油分别以(3∶1,3 h)和(1∶1,14 h)洗涤条件为最佳。染色对比结果显示,钙黄绿素对骨节部位染色较为灵敏,ARS则对第一椎骨处染色较为灵敏。结论采用Pred撤药法可诱导建立快速、稳定、灵敏的斑马鱼OP模型,是研究OP的稳定可靠模型。

斑马鱼颅骨骨组织发育特征的研究

目的:采用两种骨组织双重染色方法研究斑马鱼颅骨骨组织的发育特征,找出适合于不同发育时期斑马鱼骨组织的染色方法。方法:将不同发育阶段的斑马鱼分为两组,分别用A、B两种方法进行染色,体视显微镜下观察染色结果并拍照。结果:不同发育阶段的斑马鱼分别经A、B染色法染色软骨都被染成蓝色,但两者在骨骼上的染色有差别,对于15d以内骨化不完全的斑马鱼适合用A染色法,15d以上的斑马鱼骨化程度加重更适合用B染色法突出骨骼特征。整体来看,斑马鱼颅骨的骨化过程存在特定的程序化特征,即不同的颅骨组织按照一定的时间顺序逐步完成骨化。结论:可利用颅骨的程序化骨化特征研究人类颅颌面畸形,积极开展口腔医学领域斑马鱼模式生物学的研究。

油红O染色在斑马鱼体内脂质染色中的应用

目的探索油红O在斑马鱼体内脂质染色中的技术方法。方法取受精后4d的斑马鱼幼鱼,4%多聚甲醛固定12h后,用油红0工作液对整鱼进行染色,比较不同的染色时间及不同的染料浓度对油红O染色效果的影响。结果斑马鱼脑组织、卵黄囊、鱼鳔及血管内的脂质被油红O染色。油红0液浓度0.3%、染色时间3h时斑马鱼整鱼油红O染色效果较好。结论油红O可对斑马鱼体内的脂质进行染色,可用于斑马鱼脂代谢研究。

过度喂养建立斑马鱼幼鱼肥胖模型

目的探讨利用过度喂养的方法建立斑马鱼幼鱼肥胖模型。方法将7 dpf大小幼鱼随机分为30 mg/d正常喂养组和180 mg/d过度喂养组,每组100条,喂养20 d。分别测量每组幼鱼体质量、体长、BMI、TG和TCH含量,整体油红O染色、冰冻切片油红染色和HE染色观察幼鱼肝脏病理改变。尼罗红染色活体观察幼鱼肝内脂滴和体内脂肪组织动态变化。结果过度喂养组幼鱼体质量、体长、BMI和TG含量比与正常喂养组明显增加。整体油红O染色和病理学结果显示过度喂养幼鱼肝脏脂肪变性率(89.4%)比正常喂养(20.7%)明显高,肝脏出现大泡性脂肪变性。尼罗红染色观察到过度喂养幼鱼肝内脂滴聚集;随着喂养时间延长脂肪组织聚集逐渐增多且分布部位增加。饥饿状态下幼鱼脂肪和肝内脂滴被动员消耗而重新喂养后脂肪组织重新被诱导。结论用过度喂养方法成功建立斑马鱼幼鱼肥胖模型,尼罗红染色为活体观察幼鱼脂肪和肝内脂质提供很好的实验方法,为研究肥胖提供实验模型。

斑马鱼血管内脂代谢研究方法的构建

目的构建系统的斑马鱼血管内脂代谢的研究方法。方法利用油红O染色、荧光探针标记、直接血脂检测等方法研究斑马鱼胚胎、幼鱼、成鱼等不同发育时期血管内的脂质代谢,以及不同饮食对斑马鱼血脂的影响。结果油红可将斑马鱼胚胎血管内的脂质染色,荧光探针可荧光标记斑马鱼胚胎血管内的胆固醇。喂食蛋黄液可升高斑马鱼幼鱼的血脂水平,油红O染色可反映这种血脂的变化。高胆固醇饮食可升高斑马鱼幼鱼血管内胆固醇水平,荧光探针可标记幼鱼血管内胆固醇的变化。血脂检测显示高脂饮食的斑马鱼血清总胆固醇和甘油三酯均高于普通饮食的斑马鱼。结论本研究利用油红O染色、荧光探针标记及血脂检测等技术构建了斑马鱼不同发育阶段血管内脂代谢的研究方法。

红斑马鱼体色观察及敲除mitfa基因对其体色发育的影响

斑马鱼(Danio rerio)是一种常见的模式生物,红斑马鱼为小型观赏性鱼类之一。鱼类体色主要是由皮肤或鳞片上的色素细胞的种类和分布决定的。黑色素细胞诱导转录因子(MITF)主要调控动物黑色素细胞发育和分化。本文观察了红斑马鱼成鱼的背鳍、臀鳍、腹鳍、胸鳍色素细胞的组成和分布,跟踪观察了红斑马鱼早期体色发育过程。通过CRISPR/Cas9基因敲除技术构建了mitfa基因敲除体系,研究了mitfa基因在红斑马鱼早期体色发育中的作用。结果表明:1)红斑马鱼鳍上分布有红色素细胞、黄色素细胞和少量的虹彩细胞,但背鳍有大量的黑色素细胞;2)在红斑马鱼早期体色发育过程中,首先出现黑色素细胞,接着出现黄色素细胞,一个月后,红斑马鱼的黑色素细胞消退,鱼体表变浅红,变色中体表颜色逐渐加深,最后呈红色、银白色条纹相间分布的成鱼体色;3)利用CRISPR/Cas9技术,敲除mitfa基因,结果发现,mitfa的缺失导致早期红斑马鱼黑色素细胞显著减少。上述研究结果将为观赏鱼的选育以及建立人工改良鱼类体色有效途径提供重要的理论支撑。

红参水煎液对斑马鱼血管生长干预作用的实验研究

目的观察红参水煎液干预斑马鱼血管生长的作用,为红参的临床应用提供依据。方法建立斑马鱼正常血管生长模型,加入不同浓度的红参水煎液,观察对斑马鱼肠下静脉情况。采用血管内皮生长因子酪氨酸酶抑制剂Ⅱ(VRI)建立斑马鱼血管损伤模型,采用不同浓度红参水煎液干预,观察斑马鱼脊背节间血管情况。结果红参水煎液各浓度组平均交叉数与空白对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05);红参水煎液3μg/mL组、30μg/mL组、100μg/mL组出芽数多于空白对照组(P<0.01);红参水煎液10μg/mL组血管直径较空白对照组明显增加(P<0.05)。在斑马鱼血管损伤模型中,与空白对照组比较,VRI组及红参水煎液各浓度组完整血管个数明显减少(P<0.01),缺陷血管明显增多(P<0.01);与VRI组比较,红参水煎液1μg/mL组完整血管数增多(P<0.05),红参水煎液3μg/mL组、10μg/mL组、30μg/mL组、100μg/mL组完整血管明显增多(P<0.01),红参水煎液10μg/mL组、100μg/mL组缺陷血管数明显减少(P<0.01)。结论红参水煎液有一定促进斑马鱼血管生长的作用,并能够抑制VRI诱导的血管损伤。

赤点石斑鱼卵型芳香化酶基因启动子调控绿色荧光蛋白在斑马鱼早期生殖腺中的表达

P450芳香化酶(P450arom)是生物体内合成雌激素的关键酶。为研究赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)卵型芳香化酶基因(EaCyp19a1a)启动子的调控作用,构建了EaCyp19a1a启动子9个不同的5′端缺失片段与绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)组成的表达载体,分别命名为pEaCyp19a1a-EGFP1-9。在COS-7细胞中的瞬时转染实验证明载体pEaCyp19a1a-EGFP7具有很强的转录活性。通过显微注射,将线性化的pEaCyp19a1a-EGFP7载体注入斑马鱼单细胞期受精卵中,定期在荧光显微镜下观察GFP的表达。结果发现GFP在胚胎期(受精后约48h)开始表达,主要发生在斑马鱼早期生殖腺细胞中,具有明显的性腺特异性。这说明EaCyp19a1a的启动子序列中含有调控其性腺特异表达的顺势作用原件。研究为进一步探明芳香化酶在鱼类性别分化和性别转变过程中的作用奠定了基础。

管花肉苁蓉提取物通便作用的实验研究

目的:制备管花肉苁蓉提取物,分析主要成分,研究其通便作用。方法:测定管花肉苁蓉提取物中水分、灰分、总蛋白、多糖、总黄酮及总苷的含量;采用斑马鱼肠道染色荧光模型,观察管花肉苁蓉对斑马鱼肠蠕动的促进作用。结果:管花肉苁蓉提取物中的多糖是主要成分,含量为40.27%,总苷和总黄酮总含量近25%,另外含有少量的蛋白成分(7.61%),水分和灰分总含量不高于8%;管花肉苁蓉提取物在浓度为200μg/mL、667μg/mL和2000μg/mL时对斑马鱼肠蠕动均有促进作用,呈现浓度依赖性,最高促进率可达23.26%,且在所有浓度下没有对斑马鱼造成死亡。结论:此提取物安全无毒,并且保证药效,可开发成预防或治疗便秘的保健食品或者药品。

斑马鱼髓系造血细胞缺陷突变体的大规模遗传筛选

目的通过大规模化学遗传学方法筛选斑马鱼髓系造血缺陷突变体。方法利用化学诱变剂乙基亚硝基脲(ENU)将雄鱼精原母细胞诱变,通过与AB野生型雌性斑马鱼交配产生F1代,源自不同founder(F0)的F1代同胞之间交配产生F2家族,F3代来F2家族同胞内交配,并分别以中性红和苏丹黑B染色筛选巨噬细胞和粒细胞缺陷突变体。结果我们筛选了350个F2家族,共1424对鱼。初步筛选到6个斑马鱼髓系造血系统的突变体,其中3个突变体为中性红染色异常,另3个突变体为苏丹黑染色异常,表明以上突变体可能存在巨噬细胞或粒细胞的发育障碍。结论 ENU化学诱变和中性红及苏丹黑B染色筛选斑马鱼髓系造血缺陷突变体是简单、价廉、有效的化学遗传学方法。通过保留突变体对后代进行进一步的研究分析,有望鉴定和克隆影响斑马鱼髓系造血新的基因或已知基因的新的调控途径。

一种斑马鱼原始造血髓系细胞突变体的研究

目的斑马鱼原始造血髓系细胞突变体1276的表型鉴定及性状分析。方法利用化学诱变剂N-乙基-N-亚硝基脲诱变野生型AB斑马鱼雄鱼的精原细胞,突变基因组保留传代,采用中性红染液对F3代的胚胎进行细胞化学染色,筛选原始造血髓系细胞突变体。并通过细胞化学染色及检测不同谱系血细胞标记基因在不同发育阶段的mRNA及蛋白的表达水平,对其中之一突变体1276进行表型鉴定及性状分析。结果成功筛选1296个F2家族,2140个突变基因组,发现中性红染色信号异常突变体12个。突变体1276在原始造血阶段,中性红染色全身信号缺失,小胶质细胞标记基因apoe表达缺失,巨噬细胞标记基因l-plastin,头部表达减少,背主动脉壁腹侧区域表达正常,粒细胞、红细胞均未见异常;在定向造血阶段,巨噬细胞仍存在异常,但粒细胞、红细胞、淋巴细胞以及造血干细胞均未见明显异常。结论突变体1276在原始造血阶段,巨噬细胞存在功能障碍,以及不同程度发育及迁徙异常;在定向造血阶段这一性状并未得到代偿。

opn1lw2基因在红光诱导斑马鱼皮肤色素细胞形成中的作用

为了探究感红光视蛋白2基因opn1lw2在红光诱导斑马鱼(Danio rerio)皮肤色素细胞形成中的作用,针对AB品系野生型斑马鱼利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除感红光视蛋白2基因opn1lw2,构建opn1lw2缺失的纯合opn1lw2^(-/-)品系。使用光强(800±100)lx的红光LED灯(每天光照24 h)对15日龄野生型斑马鱼和opn1lw2^(-/-)品系斑马鱼进行60 d水面照射,发现野生型斑马鱼背部皮肤黑色素细胞数量显著多于opn1lw2^(-/-)品系斑马鱼。实时荧光定量PCR分析发现,黑色素细胞标记基因kit在野生型斑马鱼背部皮肤表达量显著高于opn1lw2^(-/-)品系,黄色素细胞标记基因csf1ra和虹彩细胞标记基因pnp4a在opn1lw2^(-/-)品系及野生斑马鱼背部皮肤表达无显著差异。表明红光能通过opn1lw2基因调控斑马鱼背部皮肤黑色素细胞的形成,但不影响皮肤黄色素细胞和虹彩细胞的形成;而且,调控黑色素细胞分化的α-MSH促黑激素的前体基因pomca在红光持续照射60 d的opn1lw2^(-/-)品系斑马鱼背部皮肤中的表达显著低于野生型,表明红光通过opn1lw2基因调控pomca基因的表达从而诱导黑色素细胞的形成。实时荧光定量PCR检测发现,野生型斑马鱼皮肤中视黄醛脱氢酶基因raldh3表达量显著高于opn1lw2^(-/-)品系,而视黄醛脱氢酶基因raldh2的表达,在两种类型斑马鱼中没有差异,表明opn1lw2基因可介导红光诱导视黄醛脱氢酶基因raldh3表达,进而调控黑色素细胞的形成。这些结果对于深入理解红光诱导鱼类皮肤色素细胞形成有重要帮助。

产紫青霉突变菌株Li-3-9的发酵条件优化及红色素安全性评价

本实验对前期研究得到的具有高产红色素能力的产紫青霉突变菌株Penicilliumpurpurogenum Li-3-9的发酵条件进行优化的同时作出了对红色素的安全性评价。在单因素试验的基础上,采用Box-Behnken试验设计优化了蔗糖浓度、酵母膏浓度和装液量对红色素色价的影响;并且研究了P. purpurogenum Li-3-9产生的红色素对斑马鱼胚胎的毒性效应。结果表明,最佳发酵条件为:蔗糖40g/L、酵母膏4g/L、装液量为45mL、接种量4%、培养温度32℃、初始pH值6.9、培养时间168h、摇床转速150r/min,红色素色价最高达到了11.4U/mL。通过计算斑马鱼胚胎致死率、心率、畸形率及孵化率可知,该色素无致死毒性,并且对斑马鱼胚胎发育具有一定的促进作用。

斑马鱼肝脏组织油红O染色方法比较优化

目的通过设置不同染色步骤、条件,探索适合处理斑马鱼肝脏的冷冻切片油红O染色方法。方法取3月龄斑马鱼肝脏OCT样品,设置6、8、10、12μm四种不同厚度切片各两片,其他各组切片厚度均为8μm,采用不同的处理方法处理两张切片。染色后置于显微镜下观察视野内组织完整度、背景情况、橘红色脂滴的染色面积、位置以及深染的细胞和位置形态。结果以4%多聚甲醛固定、10%~30%蔗糖梯度脱水,切片厚度设置8~10μm,室温晾干1 h,甲醛(4%)固定10 min,油红O染色10 min,60%异丙醇分化2 s,ddH_(2)O浸洗浸泡5 s后,苏木素染色3 min,ddH_(2)O浸泡30 s去浮色,1%盐酸酒精分化2 s,流水冲洗2 min返蓝,甘油明胶封片为条件进行油红O染色的效果较好,斑马鱼肝组织组织完整、背景清晰,脂滴染色效果较好。结论优化的斑马鱼油红O染色方法可以较为清晰地显示肝脏脂滴,可辨别细胞核轮廓位置,进而对斑马鱼肝病模型中的脂肪变性情况进行定位与半定量的分析。