Amplex Red荧光法检测组织工程瓣膜赖氨酰氧化酶活性

目的采用Amplex red荧光法检测组织工程心脏瓣膜(tissue engineered heart valve,TEHV)中赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase,LOX)的活性。方法经胰蛋白酶+乙二胺四乙酸、聚乙二醇辛基苯基醚和核酸酶处理,去除猪主动脉瓣叶的细胞成分,然后在其表面种植大鼠肌成纤维细胞,构建TEHV。用高糖培养基在体外培养瓣膜27 d,再用不含酚酞和血清的培养基培养24h,收集此时的培养基作为样本,用Amplex red荧光法检测样本中LOX的浓度,同时应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测TEHV中LOXmRNA的表达。结果样本中LOX的荧光值为45.60±1.66,根据标准曲线获得相应的LOX浓度为0.123±0.003μg/ml,同时各个TEHV均有LOXmRNA的表达,与Amplex red荧光法检测的结果相一致。结论应用Amplex red荧光法检测TEHV中LOX的活性具有可行性,并为反映LOX对TEHV细胞外基质中胶原交联的重要作用提供了方法依据。