Effect of Metal Ions on Protease Activities in the Intestines and Hepatopancreas of Red-white Ornamental Carp (Cyprinus carpio L)

[Objective] The aim of this study was to study effects of metal ions on the protease activities in digestive tissues and gland of red-white ornamental carp（Cyprinus carpio L）.[Method] Effects of four kinds of metal ions （K＋,Na＋,Mg2＋ and Ca2＋） on protease activities in hepatopancreas,foregut,midgut,hindgut of red-white ornamental carp were studied by enzyme analysis method.[Result] Effects of four kinds of metal ions on protease activities of red-white ornamental carp were different in the range of experimental concentration from 25 mmol/L to 150 mmol/L.K＋ could promote protease activities in hepatopancreas and hindgut at different levels.Especially,K＋ had the promoting effect at low-concentration level,but the inhibitory effect at high-concentration level in midgut and the inhibitory effect in foregut.Na＋ had the promoting effect on protease activities in hepatopancreas,foregut and hindgut at different levels,but the inhibitory effect in midgut.Mg2＋ and Ca2＋ had the inhibitory effect on protease activities in intestinal and hepatopancreas at different levels.[Conclusion] This study provides basic data and theoretical foundation for researches on the digestive physiology of red-white ornamental carp or the development and optimization of compound feed.

水晶彩鲫、红鲫、锦鲤、荷包红鲤杂交子代的生长和体色研究

利用人工授精的方法,进行水晶彩鲫、红鲫、锦鲤和荷包红鲤的相互杂交试验,测定各个杂交组合子代的成活率、生长速度和体色分离比例。结果表明:4种鱼能够相互杂交受精,孵出鱼苗。孵化率锦鲤自交最低为46.4%,其它组合为70%～80%;杂交鱼苗经28d的人工饲养,水晶彩鲫与荷包红鲤、锦鲤的正、反杂交,同其它杂交组合比较有明显的差别,其生长速度慢,个体之间差异大,成活率低;杂交子代的体型分为3类:鲫鱼型、鲤鱼型和鲤鲫型。鳞片反光组织(虹彩细胞或鸟粪素细胞)为2类:完全型、缺失型。体色分离复杂多样,水晶彩鲫与红鲫杂交是水晶彩鲫,红鲫与锦鲤、荷包红鲤杂交是青灰色鲤鲫杂种,水晶彩鲫与锦鲤、荷包红鲤杂交都会出现水晶彩色和青灰色鲤鲫杂种。

锦鲤4个人工雌核发育家系的微卫星标记研究

利用Crooijmansetal (1997)分离的包含CA重复单元的普通鲤鱼 (CyprinuscarpioL .)的 8个微卫星DNA标记 ,对从锦鲤 (CyprinuscarpioL .)的红白、大正和昭和 3个不同品系中所获得的 4个不同人工雌核发育家系的 2 0尾个体进行PCR扩增。电泳结果表明 ,8对引物在 2 0尾个体中均能重复稳定地扩增出相应的同源序列。随引物不同 ,各等位基因数为 1～ 11个 ,大小在 6 8～ 2 6 4bp。在MFW 4、MFW7、MFW 19、MFW 2 0、MFW 2 3和MFW 2 4 6个微卫星的扩增结果中 ,2 0尾个体的扩增图谱呈现了高度的遗传多态性 ,不同雌核发育家系内个体的遗传异质性也较大。其中大正 (TaS)和红白 1(RW1)的个体不仅花色分化显著 ,而且个体间的平均遗传距离分别高达 0 2 8。通过对微卫星等位基因和基因型分析发现 ,由于锦鲤品系中的每一个体是通过不断地杂交选育而获得 ,基因组来源复杂 ,基因高度杂合。因此 ,只进行 1代的人工雌核发育 ,其家系内仅部分个体的部分座位出现纯合。所获得的人工雌核发育锦鲤为后续的色素遗传调控机制研究提供了必要的实验材料 ;同时 ,所鉴定的微卫星分子标记为进行锦鲤的分子标记育种和基因组作图提供了理想的工具。

锦鲤总色素及色素组分的比较研究

用光谱和色谱两种方法对锦鲤的总色素和色素组分进行了研究。研究结果表明,红色锦鲤、乌鲤和绯写锦鲤总色素光谱在可见光区(448nm和470nm)有两个完全相同的吸收峰,黄写锦鲤和昭和三色锦鲤总色素光谱在可见光区(445nm和472nm附近)有两个相近的吸收峰,锦鲤所含色素组分均以杏黄色或橙色为主,其他色素组分为辅。锦鲤黑色色斑是由于黑色素存在时,其他各色素组分的颜色被黑色所掩盖;锦鲤其他色斑的形成则是由于其体内各色素组分以不同比例相互搭配组合的结果。亲缘关系越近的锦鲤其总色素组分就越相似,红色锦鲤和乌鲤均含有六种相同的色素组分,绯写锦鲤除杏黄色和橙色色素组分与前二者的同色色素组分Rf值不同外,其余四种同色色素组分的Rf值均相近;黄写锦鲤与昭和三色锦鲤分别含有三种和四种色素组分且Rf值差异显著。据此推测,红色锦鲤、乌鲤和绯写锦鲤可能具有较近的亲缘关系,而黄写锦鲤、昭和三色锦鲤与前三者之间可能具有较远的亲缘关系。该研究有望为锦鲤增色饵料的研制与开发提供理论依据,使锦鲤的观赏价值和经济价值得到进一步提高。

两个人工雌核发育红白锦鲤群体的RAPD标记分析

采用 RAPD方法 ,对两个人工雌核发育红白锦鲤群体进行了多态性及分子标记分析。结果表明 ,同一雌核发育群体具有基本一致的扩增产物 ,而不同雌核发育群体间的扩增产物则有较大不同 ;并从 3 0个随机引物的扩增谱带中找到了 7个引物 (Opo- 7,Opo- 9,Opo- 1 2 ,Opo- 1 4,Opj- 4,Opj- 8和 Opj- 1 0 )的扩增谱带可以作为两个不同雌核发育群体间的遗传标记。由 UPGMA聚类法构建的分支系统树清晰地反映了两个雌核发育群体及其个体间的相互关系。

红白锦鲤人工雌核发育纯系的微卫星标记分析

利用连续两代人工雌核发育操作 ,构建了极具观赏价值的红白锦鲤人工雌核发育系。应用 6对微卫星引物进行遗传标记研究 ,检测分析了该雌核发育系内个体间的遗传同质性及其基因座位的纯合度。实验结果显示 ,11尾经人工挑选具有相同表形、极具观赏价值的F1代性成熟个体的微卫星扩增图谱呈现出高度的一致性。同时 ,随机挑选的人工雌核发育F2代个体在所检测的基因座位均呈现纯合 ,扩增图谱呈现了高度的一致 。

盐酸沙拉沙星在锦鲤体内的药物动力学研究

用反相高效液相色谱法研究了盐酸沙拉沙星肌注给药(15 mg/kg)在锦鲤体内的药动学变化规律;用高效液相色谱仪测定取给药后不同时间的锦鲤血浆中盐酸沙拉沙星的质量浓度。用MCPKP药物动力学软件程序处理肌肉注射的血浆药物浓度与时间数据。房室模型分析表明,健康锦鲤肌肉注射给药的药时数据适合一级吸收一室开放模型,血浆中主要药物动力学参数为:Ka(1.660±0.467)/h;Ke(0.0859±0.0031)/h;T1/2Ka为(0.440±0.107)h;T1/2Ke为(8.069±0.276)h;Tm ax为(1.936±0.329)h;Cm ax为(3.290±0.888)μg/m l;AUC为(45.257±0.631)mg/(L.h)。盐酸沙拉沙星在健康锦鲤体内的主要药动学特征为:吸收迅速,达峰时间短,消除缓慢,体内滞留时间长。

锦鲤嗜水气单胞菌的分离鉴定及生物学特性研究

中山市某养殖场饲养的锦鲤于2007年突发传染病,为确诊该病并对其进行有效防制,本研究进行了病原分离及生物学特性鉴定。从发病锦鲤溃烂部位分离到2株细菌GDzs0824和GDzs0826。将2株菌人工感染锦鲤,5d后锦鲤全部死亡,而且临床症状与自然病例相似。2株菌均呈革兰氏阴性,短杆状;对葡萄糖、蔗糖、甘露醇、麦芽糖、MR、O/F、盐水和赖氨酸脱羧酶等的生化反应性与其它水生动物源的嗜水气单胞菌(Aeramonas hydrophila)相同;最适生长pH值为5～9;最适生长温度为33℃;16S rRNA基因序列分析结果显示:分离菌株在系统发育树上与A.hydrophila属同一分支,相似性达99.6%以上。综合2菌株形态学、人工感染、生理生化和16S rRNA基因分析结果,将其鉴定为A.hydrophila。药敏试验结果表明2菌株对盐酸环丙沙星、氯霉素、妥布霉素、呋喃唑酮和诺氟沙星等高度敏感。

鱼类染色体组操作的研究 Ⅰ.静水压休克诱导三倍体水晶彩鲫

采用静水压休克方法研究了促使第二极体保留诱发三倍体水晶彩鲫的最佳条件。在卵受精后4—5min采用600kg/cm^2或650kg/cm^2的静水压处理3min,不但能导致100％的三倍化,而且胚胎的存活率相当高,孵化率为对照组的90％左右。研究表明,静水压休克是进行鱼类染色体组操作的有效方法,休克的最佳条件易于掌握,处理程序易于标准化。文中讨论了静水压处理的条件与三倍体出现率和胚胎存活率的关系,以及最佳条件下和不适条件下胚胎死亡的原因。

三氯生对红白鲫运动行为的影响

利用视频跟踪系统研究三氯生(TCS)对红白鲫运动行为的影响。将红白鲫(red-white crucian carp)暴露在5种不同浓度的TCS(0.50、0.60、0.70、0.80和0.90 mg/L)水体中,视频记录5 min内红白鲫的运动轨迹(运动轨迹线、摆动次数)、游动速度和垂直穿梭次数的变化。同时,进行TCS(0.60、0.69 mg/L)对红白鲫的14 d暴露实验,暴露实验结束后,2 min内监测上述指标。结果显示:短期TCS暴露,红白鲫的运动轨迹条数、摆动次数、垂直穿梭次数、运动速率显著增加;暴露14 d后的红白鲫上述运动行为学指标显著降低。结果表明:在一定浓度范围内,TCS能够改变红白鲫的运动行为。

不同饲料对红白锦鲤生长、体色和血液生化指标的影响

研究分析了不同饲料对红白锦鲤生长、形体、体色和血液生化指标的影响。试验设4组不同饲料,依次为饲料1组(商业锦鲤饲料)、饲料2组(膨化饲料)、饲料3组(膨化饲料+螺旋藻)和饲料4组(膨化饲料+光合细菌)。试验用红白锦鲤平均体重2.41(±0.03)g,每组饲料3次重复,试验期为8周。结果显示:(1)各饲料中以饲料1组的终末重、增重率、肥满度和肝体比最低,其中终末重和肝体比显著低于其他3组饲料;(2)锦鲤体表的总类胡萝卜素含量排序为:饲料3组>饲料4组>饲料2组>饲料1组;(3)不同饲料可显著影响红白锦鲤的部分血清生化指标,各饲料组中以饲料1组的白蛋白和白球比显著高于其他各饲料组,其他3组间白蛋白和白球比无显著性差异。分析结果表明,膨化饲料中添加光合细菌和螺旋藻不但有助于促进红白锦鲤的生长,也可改善其体色。

锦鲤中吉氏库特菌的分离与鉴定

对从患病锦鲤(Cyprinus carpio L.)肝组织中分离的1株纯培养菌(HC050630C-1)进行了形态特征、主要理化特性、对健康鲤鱼的致病作用、药物敏感性等方面的检验;同时测定了该株菌的16S rRNA基因序列,构建了系统发育树。结果表明,被检菌为吉氏库特菌(Kurthia gibsonll),对健康鲤鱼未显示明显的致病作用;所测菌株的16S rRNA基因序列长度1459bp,在GenBank中登录号为EF611423;该菌株16SrRNA基因序列与GenBank数据库中吉氏库特菌的16S rRNA基因序列同源性在99%;药敏试验结果显示,对供试的氨苄青霉素等27种药物呈现高度敏感或敏感,对头孢吡肟等6种呈低度敏感,对苯唑青霉素等4种耐药。

雌核发育橙黄色锦鲤的遗传、性腺发育及外形特征

用经紫外线灭活的团头鲂精子激活橙黄色锦鲤的卵子,在4℃的水温下冷休克处理卵子30 min使其染色体加倍,获得了孵化率为30.6%、存活率为24.2%的雌核发育锦鲤,表明该雌核发育锦鲤研制方法具有较高的效率。利用外周血细胞培养方法制备了雌核发育锦鲤染色体并利用核型分析方法对其核型进行了分析,发现雌核发育锦鲤染色体数目为100,核型公式为22 m+34 sm+22 st+22 t;表明雌核发育锦鲤为二倍体,其核型与锦鲤母本一致。利用石蜡切片方法,随机选取10尾1龄雌核发育锦鲤性腺进行检测,发现其性腺全部为卵巢;并且在繁殖季节随机检测100尾2龄雌核发育锦鲤,没有1尾能挤出精液,表明雌核发育锦鲤全部为雌性,为证明雌性锦鲤的性别决定类型为XX提供了重要证据。此外,还对雌核发育锦鲤与母本的的SOX基因遗传关系、外形、体色等进行了比较,结果表明雌核发育锦鲤与母本有相同的SOX基因扩增片段,为证明其为雌核发育锦鲤而非杂交后代提供了重要证据;同时,雌核发育锦鲤保留了母本体态优美的特点,且具有色泽更鲜艳等优点,表明该雌核发育方法产生了遗传改良效果。雌核发育锦鲤的获得为该观赏鱼的提纯复壮、遗传改良以及性别决定和性别控制研究奠定了基础。

红白锦鲤的染色体核型分析

[目的]为定向育种、良种选育和制定种质标准提供参考依据。[方法]以红白锦鲤肾细胞为材料,采用PHA和秋水仙素活体注射体细胞体内培养法,经空气干燥制备了染色体,并对其染色体核型进行分析。[结果]红白锦鲤的染色体数目分布在92～100条,相对长度最长的为(29.67±2.21)‰,最短的为(13.53±0.08)‰。[结论]红白锦鲤的染色体数2n=100,核型公式为:22m+34sm+22st+22t,染色体臂数(NF)=156。

鱼类染色体组操作的研究 Ⅱ.静水压处理和静水压与冷休克结合处理诱导水晶彩鲫四倍体

采用静水压处理和静水压与冷休克结合处理两种方法进行了抑制第一次卵裂诱导水晶彩鲫四倍体的研究。水晶彩鯽受精卵在受精后(发育水温14—15℃)50、54、55和60min时的静水压(650kg/cm^2)处理(3min)组中都出现了四倍化胚胎,而在受精后48和48min以前的相同处理组中都没有观察到四倍化胚胎。在受精后(发育水温16-18℃)48、50、52、55、56和60min时的静水压与冷休克结合处理组中,也都出现了四倍化胚胎,且四倍化率比仅用静水压处理高,但存活率更低。在经过处理而发育形成的胚胎中,既有四倍体、次四倍体和4n/2n嵌合体,也有二倍体和次二倍体,并在一些次二倍体和次四倍体中期相中还观察到休克处理致使染色体断裂的痕迹——染色体片段。在抑制卵裂诱发加倍的效应期内,可能存在瞬间对休克耐受性较强的时期,而在此前后,对休克更为敏感。在少数处理组中,已筛选出了数尾四倍体鱼。文中还对鱼类四倍体的诱导技术、抑制卵裂诱发染色体组加倍的效应期以及四倍化胚胎的存活率和生命力等有关问题进行了分析和讨论。

锦鲤组织细胞体外培养的初步研究

为建立来源于锦鲤的细胞系,本文采用组织块法,对来源于锦鲤(Cyprinus carpio)鳍条、吻端、肌肉、心脏、鳔、肠道、卵巢等组织的细胞进行原代培养和传代培养。在25℃下,添加20%胎牛血清、0.2μg/mL表皮生长因子(EGF)和25ng/mL成纤维生长因子(FGF)的L-15培养基中进行培养。结果显示,鳍条、心脏、鳔、吻端、肌肉、肠道、卵巢分别在原代培养第3、6、12、13、15、3、3天,有细胞从组织块迁出;对长至单层的鳍条、心脏、肌肉细胞进行传代培养,鳍条细胞已传至第39代,心脏和肌肉细胞分别传到第2代和第4代;鳍条、心脏和肌肉细胞分别呈现上皮细胞样、上皮细胞样和上皮细胞样与成纤维状混合型。第6代锦鲤鳍细胞的染色体计数,结果显示,细胞染色体数目分布范围为55～154条,2n=100。病毒敏感性实验,发现锦鲤鳍条细胞对草鱼出血病病毒(GCRV)和鲤春病毒血症病毒(SVCV)都敏感,且在24h内出现细胞病变(CPE);但对斑点叉尾鮰病毒(CCV)不敏感。锦鲤鳍条细胞系的建立为后期建立更多的锦鲤细胞系和鱼类病毒研究奠定了基础。

金属离子对红白锦鲤肠及肝胰脏蛋白酶活性的影响

[目的]研究金属离子对红白锦鲤消化组织蛋白酶活性的影响。[方法]以酶学分析方法研究4种金属离子(K+、Na+、Mg2+、Ca2+)对红白锦鲤肝胰脏、前肠、中肠、后肠蛋白酶活性的影响。[结果]在设定的浓度范围内(25～150mmol/L),4种金属离子对蛋白酶活性影响不同。K+对肝胰脏和后肠的蛋白酶活性有不同程度的促进作用,其中K+对中肠表现为低浓度促进,高浓度抑制的作用,对前肠蛋白酶表现为抑制作用;Na+对肝胰脏、前肠和后肠的蛋白酶表现为不同程度促进作用,对中肠表现为抑制作用。Mg2+、Ca2+对肠及肝胰脏的蛋白酶均表现为不同程度的抑制作用。[结论]该研究可为红白锦鲤消化生理的研究以及配合饲料的开发、优化提供基础数据和理论依据。

盐藻、辣椒粉及温度对红白锦鲤生长及着色的影响

以体重(22.76±3.59)g的红白锦鲤为试验对象,采用正交设计方法研究盐藻、辣椒粉和温度对红白锦鲤生长和着色的影响。养殖周期为70 d,试验分别在第15、30、40、50、60、70 d采集鳞片、皮肤、头、鳍条进行色素吸光度测定。结果表明:投喂40 d后,影响红白锦鲤生长和各部位总类胡萝卜素含量强弱顺序为盐藻>辣椒粉>温度,即试验最佳条件为添加盐藻0.4 g/kg、辣椒粉20 g/kg或30 g/kg,温度27℃,投喂时间为40 d。50 d后,色素持续性较好。

锦鲤中琼氏不动杆菌的分离与鉴定

对从病死锦鲤(Cyprinus carpioL.)肝组织中分离的2株菌(编号:HC050630D-1、HC050630D-2)进行了形态特征、理化特性、药物敏感性及对健康鲤鱼的致病作用等方面的检验;测定了HC050630D-1株菌的16S rRNA基因序列,构建了系统发育树。结果表明,2株被检菌为琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii),对健康鲤鱼未呈现明显致病作用;所测菌株的16S rRNA基因序列长度1450bp,在GenBank中登录号为EF669479,该菌株16S rRNA基因序列与GenBank数据库中不动杆菌属细菌的16S rRNA基因序列同源性为99%;药敏试验结果显示对供试的头孢拉啶等21种药物呈现高度敏感或敏感,对头孢他啶等7种呈低度敏感,对青霉素G等9种耐药。

锦鲤溃疡病病原菌的分离及16S rRNA鉴定

为寻找引起养殖锦鲤(Ornamental carp)病害的致病因子,从北京地区自然患病的锦鲤体内分离疑似致病菌,再将此菌人工感染健康锦鲤,确定致病菌。采用生理生化鉴定与16SrRNA基因序列的系统发育学分析相结合的方法确定该致病菌株的系统发育地位,同时采用琼脂扩散法测定该菌对抗菌类药物的敏感性。试验结果表明,从病鱼体内分离得到革兰氏阴性杆菌CL0901,人工感染健康锦鲤后,能够引起鱼生病甚至死亡,症状与自然发病症状一致。菌株CL0901与Aeromonasveronii ATCC 35624T的16SrRNA基因序列相似性达99.9%,构建系统发育树,并结合形态特征与生理生化测定结果,将该致病菌鉴定为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)。在21种抗菌类药物对该菌的抑菌试验中,左氧氟沙星、诺氟沙星和洛美沙星等10种药物的抑菌效果较好。本研究为进一步防制锦鲤养殖病害提供依据。