CRISPR/CAS9敲除PD-1的肿瘤浸润T淋巴细胞回输对小鼠结肠癌的治疗作用

目的:探讨应用成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas9)技术敲除程序性死亡分子-1(PD-1)的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)回输对结肠癌小鼠的治疗作用。方法:皮下注射CT26构建小鼠结肠癌模型,从3只模型小鼠肿瘤组织中提取TIL,并提取外周血淋巴细胞;对TIL进行PD-1基因敲除;回输实验分为对照组(Control)、输注淋巴细胞组(Lym)、输注荷瘤小鼠TIL组(TIL)、慢病毒空载对照组(pVSV-G-PX458-NC)组、PX458-PD-1-sgRNA1组(PD-1-sgRNA1),每组10只;测量各组小鼠肿瘤组织质量及肿瘤抑制率;TUNEL法检测各组小鼠肿瘤组织细胞凋亡;ELISA检测各组小鼠肿瘤组织TNF-α和IFN-γ含量;免疫组化检测肿瘤组织CD4+T、CD8+T细胞表达;免疫荧光法检测肿瘤组织细胞增殖核抗原-67(Ki-67)和血管内皮生长因子(VEGF)表达;Western blot检测肿瘤组织PD-1及其主要配体PD-L1表达。结果:PD-1-sgRNA1能明显抑制小鼠肿瘤细胞体内生长,抑制肿瘤组织Ki-67和VEGF表达及PD-1、PD-L1表达,提高肿瘤组织细胞凋亡率、TNF-α、IFN-γ含量、CD4+T、CD8+T细胞表达(均P<0.05)。结论:CRISPR/CAS9敲除PD-1的TIL回输能明显抑制结肠癌小鼠肿瘤组织Ki-67和VEGF表达,增加CD4+T、CD8+T细胞,诱导肿瘤细胞凋亡,发挥抑制肿瘤生长作用。

利用CRISPR/Cas9系统创制水稻品种GW2基因的突变体

培育具有育种价值的GW2基因编辑的水稻优异新品种在水稻育种中具有重要意义,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以生产上广泛推广应用的13份水稻品种为材料,对粒质量基因(GW2)进行定向性状改良,通过农杆菌转化创制出一批无T-DNA元件的水稻非转基因GW2突变纯合株系。结果表明:13份T0代水稻转基因中,有28.0%~59.1%植株的GW2基因发生了突变,纯合突变株数量占总突变株数量的35.0%,双等位突变株数量占总突变株数量的14.2%,杂合突变株数量占总突变株数量的50.8%。此外,不同水稻品种发生的突变类型也略有不同。对13份T2代非转基因水稻GW2突变纯合株进行千粒质量性状的考种分析。与对应的野生型亲本品种相比,纯合突变水稻植株的千粒质量显著提高10.81%~58.22%。本研究结果极大地丰富了GW2的突变类型,为不同水稻品种的高产稳产创造了重要的种质资源,同时也为利用基因编辑提高水稻产量提供了有价值的育种信息。

CRISPR/Cas9技术在热带作物育种中的应用研究进展

在热带地区种植的香蕉、番木瓜、甘蔗、木薯、天然橡胶、油棕等热带作物,是我国农业的重要组成部分,不仅为我们的日常生活和工农业生产提供了重要的原材料,而且为我国热带与亚热带地区的主要农业产量和经济增长做出了贡献。然而,这些作物的现代分子育种受其生物学特性和遗传复杂性的严重阻碍,多倍化、杂合性、无性繁殖、童期长和植株高大等问题导致热带作物的传统杂交育种周期长、难度大、进展慢。基因编辑技术的发展为热带作物育种带来了新途径和新机遇。CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑技术以其更高的靶向效率、多功能性和易用性,已被广泛应用于植物基因组编辑育种中。近年来,该技术在香蕉、木薯、天然橡胶、甘蔗等热带作物上也实现了广泛应用。本文介绍了基于CRISPR-Cas9系统的基因组编辑、CRISPR-Cas9在热带作物改良中的应用进展以及所面临的挑战和问题,同时对热带作物基因编辑育种方面提出建议,以期为后续研究提供思路,并为进一步开发应用该技术以有效改良热带作物的植物性状提供参考。

橡胶树CRISPR/Cas9编辑植株出现预期表型的突变阈值

本课题组前期在橡胶树原生质体中分别实现了基于CRISPR/Cas9-RNP及质粒介导的瞬时转化基因编辑,并以HbPDS基因为靶标,在橡胶树愈伤组织中实现了农杆菌介导的稳定转化基因编辑,并获得了出现白化表型的愈伤组织,但由于橡胶树愈伤诱导体胚的技术还不稳定,导致未能获得基因编辑植株。为了获得橡胶树基因编辑幼苗,本研究继续以HbPDS基因为靶标,改用橡胶树体胚为侵染受体,开展农杆菌介导的遗传转化,经潮霉素抗性筛选获得增殖的T_0代抗性体胚,通过Cas9基因分子检测共挑选出116个阳性转化体胚,通过对靶点处的测序检测发现有5个胚块发生了基因编辑,编辑效率为4.3%。通过植株再生程序,获得了2株再生植株,表型观测均是嵌合体,表现为同一编辑植株上同时存在绿色及白化叶片。同时取白化叶片和绿色叶片进行高通量测序,发现二者均已发生了基因编辑,除了1个白化叶片发生了纯合双等位突变之外,其余叶片均为嵌合突变。其中,白化叶片编辑细胞的占比介于86%~100%之间,而绿色部位编辑细胞所占比例介于66%~69%之间,说明橡胶树CRISPR/Cas9编辑植株出现预期表型的突变阈值高于69%,介于70%~85%之间,为今后创制有表型的橡胶树基因编辑幼苗提供理论指导。同时,本研究证明了T_0代转化体胚及其获得的再生植株嵌合比例太高,不宜作为植株再生的材料,为今后通过对T_0代阳性体胚进行继代获得T_1代纯合体胚,并以T_1代体胚为转化受体获得纯合基因编辑植株提供思路。本研究首次公开报道获得了橡胶树基因编辑植株,尽管是嵌合植株,但也增进了对CRISPR/Cas9在橡胶树中作用的理解,为下一步在橡胶树中改进并应用基因编辑技术奠定基础。

CRISPR/Cas系统在核酸检测中的应用和挑战

成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关基因(Cas)系统是古菌和细菌适应性免疫系统,最初被发现用来进行基因编辑,近年其特异识别和切割特性以及可编程性使其在核酸和非核酸靶标检测中崭露头角。目前基于CRISPR/Cas系统的核酸检测系统主要与核酸扩增技术如PCR、链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)和EXPAR等恒温扩增技术结合,以提高灵敏度;多项研究也在尝试开发基于CRISPR/Cas的无预扩增核酸检测系统;另外也有研究尝试通过生物祖体(包括适体、DNAzymes和抗原-抗体反应)特异性识别靶物质实现非核酸信号转换为核酸信号,实现基于CRISPR/Cas的蛋白质、小分子、细胞等非核酸物质的检测。但仍存在一些挑战,其中目标中痕量原始浓度的信号转换和放大是分析系统的关键挑战;其他挑战包括CRISPR/Cas存在一定背景活性,CRISPR RNA和单链DNA/单链RNA信号报告序列有降解风险等。随着技术的逐渐成熟,CRISPR/Cas系统将在生物靶标检测中发挥更大作用。本文就CRISPR/Cas系统在核酸检测这一领域的最新发展方向作一述评。

基于CRISPR/Cas12a的叶酸代谢位点MTHFR基因C677T多态性检测方法的建立

目的开发一种基于CRISPR/Cas12a技术的叶酸代谢位点c.677(MTHFR C677T)的高效检测方法,以实现对C677T多态性的快速、准确分析。方法采用重组酶聚合酶扩增(RPA)结合CRISPR/Cas12a建立单管检测反应体系,建立人MTHFR基因C677T基因分型策略;测试200例孕妇人群样本MTHFR基因C677T多态性,并与常规PCR产物测序结果进行一致率比较。结果基于CRISPR/Cas12a检测人MTHFR基因C677T多态性的检测方法结果准确、特异性好,与PCR产物测序结果具有高度一致性。结论建立的基于CRISPR/Cas12a检测技术的人MTHFR C677T基因分型方法简单、快捷、精准,为叶酸代谢位点MTHFR C677T基因型检测提供了新的途径,具有潜在的临床应用前景。

利用CRISPR/Cas9构建敲除小鼠模型研究PPP2R3A基因对心脏功能的影响

目的 应用CRISPR/Cas9技术构建蛋白磷酸2调节亚基B″家族α亚型(PPP2R3A)基因敲除小鼠,从分子水平及组织水平上研究PPP2R3A缺失对心脏的影响。方法 将Cas9 mRNA和两个靶向PPP2R3A第3外显子翻译起始密码子附近区域的单导向RNA微注射到C57BL/6小鼠受精卵中。小鼠出生后取其基因组DNA进行聚合酶链反应(PCR)和测序以鉴定基因型,鉴定后,基因PPP2R3A缺失型小鼠为KO组,野生型C57BL/6小鼠为WT组(雄性3只,雌性2只)。小鼠心脏组织经甲醛固定并制成切片后分别进行苏木素-伊红(HE)染色和免疫组织化学染色。提取小鼠心脏组织总RNA和蛋白,应用荧光定量PCR和Western印迹验证基因敲除小鼠的有效性和检测互作蛋白表达。结果 获得F1代PPP2R3A杂合小鼠,PCR和测序结果表明突变小鼠的基因型存在113 bp的缺失突变。与WT组相比,KO组心脏组织中PPP2R3A mRNA和蛋白表达量明显下降(均P<0.05),参与心脏发育的G蛋白信号转导调控因子(RGS)19表达量明显升高(P<0.05)。PPP2R3A蛋白表达受损引起了心脏组织病理学变化。结论 PPP2R3A在体内可能通过与RGS19蛋白互作来参与心脏的发育并对心脏功能产生影响。

基于CRISPR/Cas9的棉花GhbHLH71基因编辑突变体的分析

碱性/螺旋-环-螺旋(basic/helix-loop-helix,bHLH)转录因子在植物的生长发育、次生代谢、信号转导、逆境胁迫等方面起重要的调控作用。棉花GhbHLH71基因c DNA全长996 bp,编码331个氨基酸残基,蛋白序列中含有保守的bHLH结构域,属于bHLH转录因子家族成员。实时荧光定量分析结果表明,GhbHLH71基因在棉花纤维快速伸长期3~12 DPA (days post anthesis,DPA)相对高表达,暗示其主要在棉花纤维发育过程中发挥作用。构建该基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体进行了棉花遗传转化,T_0代再生株经过Cas9基因的PCR检测以及靶位点突变情况检测分析,获得6个T_0代基因编辑突变体。T_1代不同突变株系在棉花生长发育期的表型性状与对照相比无明显差异,但成熟纤维的长度与对照相比皆明显变短。T_2代突变株系可以稳定遗传T_1代株系纤维变短的表型。其中4#和8#株系连续2代的纤维长度与对照相比缩短比率皆达20%以上,表明GhbHLH71基因的突变主要影响了棉花纤维细胞的伸长。本研究为深入了解棉花中bHLH转录因子的生物学功能以及棉花纤维发育的分子机制提供了一定的参考。

发根农杆菌介导的甜瓜CRISPR/Cas9系统靶位点的检测

选取甜瓜栽培材料龙庆八号作为受体材料,构建CmCURT1A基因CRISPR/Cas9基因编辑载体,经发根农杆菌介导检测靶位点的编辑情况,为后续甜瓜遗传转化试验提供载体基础。以甜瓜CmCURT1A基因(ID:MELO3C006053.2)为靶基因构建双靶位点敲除载体,经发根农杆菌K599介导的简单遗传转化技术使甜瓜组织长出不定根,经PCR测序发现在不定根中分别存在65 bp、72 bp不同碱基片段的缺失。该方法成功进行了甜瓜CRISPR/Cas9载体靶位点敲除情况的检测,简单高效,实现了在甜瓜中基因编辑靶点的快速鉴定,为研究甜瓜基因功能和遗传改良奠定基础。

CRISPR/Cas-等温扩增技术在食源性病原菌检测中的研究进展

食源性病原菌引起的食品安全事件引起广泛关注,为保证食品安全,采取有效的检测手段至关重要。新兴的簇状规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及其关联蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)组成的CRISPR/Cas系统是广泛存在于细菌和古细菌中的一种获得性免疫系统,可高效、特异性识别并切割外源核酸,与传统技术相比在检测病原菌方面更为高效。本文基于CRISPR/Cas生物传感系统-等温扩增技术联用的相关研究进行综述,对CRISPR/Cas系统的分类、原理以及与等温扩增耦合后在食源性病原菌检测方面的研究进展进行概述,并对其在即时检测应用中的前景以及所面临的挑战进行深入探讨,以期为CRISPR/Cas生物传感系统的进一步发展提供参考。

利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼prkd1基因敲除品系

蛋白激酶D1 (protein kinase D1, PKD1;也称作PRKD1)是蛋白激酶家族成员之一,该家族由3种结构相关的应激激活酶组成,可调节机体多种生物学功能,主要涉及细胞增殖、分化、凋亡、免疫调节、心脏收缩、血管生成和癌症等,其中PRKD1与心脏肥大、收缩和缺血再灌注损伤的底物磷酸化有关。相关研究报道,先天性心脏病患者存在PRKD1基因突变,但其在心脏中的特异性功能和分子机制并未阐明。为了便于后期研究PRKD1基因在人类早期心脏发育的作用机制,本文拟利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼prkd1基因敲除品系。首先,通过生物信息学网站筛选出两个最佳的基因敲除靶位点,合成相应靶位点的单链向导RNA (single guide RNA,sg RNA)和引物;然后,将两个靶位点的sg RNA进行体外转录,并将其与Cas9蛋白混合后共同注射到斑马鱼的1-细胞期;最后,对基因敲除后的F0、F1、F2及F3代斑马鱼的胚胎和成鱼进行有效性鉴定及表型观察。结果显示,靶位点附近出现了不同程度的碱基缺失;成功构建了F1代能够稳定遗传的prkd1基因敲除的3个亚系;与野生型相比, F3代纯合子胚胎表现出不同程度的心腔膨大、环化异常及心管线性化等畸形现象。综上可知,本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了斑马鱼prkd1基因敲除品系,为进一步研究该基因在人类心脏发育中的特异性功能提供了有益参考,并为后期的先天性心脏病筛查和精准医疗提供了重要依据。

基于CRISPR/Cas系统的生物传感器在动物疫病诊断中的应用

动物疫病不仅严重危害动物健康,阻碍养殖业良性发展,而且对人类健康构成潜在威胁。开发灵敏、特异、快速的诊断方法对于疫病防控尤为重要。PCR是目前检测病原体核酸的金标准,但是它存在检测周期较长,需要精密仪器和专业技术人员,无法应用于现场即时检测等局限性。成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein,CRISPR/Cas)具有敏感性高、特异性强和操作简便等优点,可为动物疫病诊断提供新的方法和契机。CRISPR-Cas9靶向核酸的特异性和CRISPR-Cas12/Cas13“附属切割”活性使其在核酸检测中显示出巨大的应用前景。本文简述了CRISPR/Cas系统的分类,对3种常用的CRISPR/Cas系统的核酸检测策略进行系统阐述,并对其在动物疫病诊断中应用的最新研究进展进行综述,最后讨论了它的优势、面临的挑战及未来发展方向,以期为动物疫病诊断新方法的开发提供参考。

利用CRISPR/Cas9技术编辑GmBADH1基因改变大豆耐盐性

耐盐基因功能鉴定对于大豆品种改良以及盐碱地的开发利用至关重要。盐害胁迫下作物通过合成和积累甜菜碱作为渗透保护剂,减小盐害对作物产量的影响。BADH基因已在多种植物中被证实调节植物对逆境胁迫的响应,但在大豆中的调控机制尚不清晰。本研究克隆了GmBADH1基因,qRT-PCR显示该基因在根、茎、叶中均有表达,尤其在根中的表达丰度最高。通过农杆菌介导的大豆遗传转化技术将CRISPR/Cas9系统构建的表达载体转入到大豆品种JACK中,产生了3种可以调控大豆耐盐性状的靶向突变,均发生在编码区,分别为缺失19 bp、插入1 bp、插入9bp替换2 bp。前两者,过早出现的终止密码子,使其均产生截断的BADH1蛋白,后者发生移码突变。在出苗期和苗期分别对突变纯合植株进行盐处理,结果表明,出苗期耐盐性与野生型相比显著下降,苗期与野生型相比无明显差异。这说明GmBADH1基因可能主要调控出苗期的耐盐性状。本研究为深入挖掘大豆耐盐基因和培育大豆耐盐品种提供了依据。

利用CRISPR/Cas9技术敲除OsNramp5创制镉低积累水稻新种质

大米镉超标问题严重威胁人体健康。水稻镉吸收转运基因OsNramp5的功能缺失可有效降低镉在稻米中的积累。为了快速创制镉低积累的水稻新种质,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除三系杂交稻优质抗病恢复系川恢491(R491)中的镉吸收转运基因OsNramp5,获得了多种不同突变方式的编辑植株,并筛选出单靶点突变无转基因成份的两种纯合突变株系(KO1和KO2)。在镉污染土壤中种植并测定野生型和敲除植株糙米的镉含量,结果显示,相比于野生型R491,敲除株系KO1和KO2糙米中的镉含量显著下降,均降低约90%左右。农艺性状调查结果发现,相比野生型R491,KO1突变株系的农艺性状没有显著差异,但KO2突变株系的株高、结实率和千粒重显著降低。因此,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除镉吸收转运基因OsNramp5可快速创制镉低积累的水稻新种质,本研究创制的新种质为加速培育可在镉污染区种植的安全水稻品种提供了新的遗传资源。

基于CRISPR/Cas9技术的全基因组基因编辑MDCK细胞文库的构建

本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,首先靶向犬全基因组设计合成转录sgRNA的DNA文库,并将DNA文库全部克隆于lentiCRISPR v2慢病毒转移载体上,高通量测序结果显示文库覆盖度高、均一性良好。将质粒文库和慢病毒包装系统质粒共转染293T细胞,收取含慢病毒样病毒的上清液感染MDCK细胞,在最适浓度嘌呤霉素筛选下,收集嘌呤霉素抗性细胞,冻存于-80℃,提取一部分细胞的基因组,通过PCR扩增转录sgRNA的DNA,将PCR产物插入到T载体后,挑取单克隆菌落,测序表明细胞文库中转录的sgRNA具有较好的覆盖度。本实验成功构建了犬全基因组范围转录sgRNA的质粒文库,并成功构建了MDCK细胞全基因组范围的基因编辑细胞库,该文库可作为后续筛选病毒复制关键宿主因子的细胞平台。

CRISPR/Cas基因编辑及其新兴技术在丝状真菌研究中的系统应用

丝状真菌(filamentous fungi)具有独特的形态和细胞构造,与人类健康和工农业生产息息相关,对这类生物资源的开发和利用高度依赖高效的基因编辑平台。然而,由于丝状真菌复杂多样的遗传背景,使用传统的基因编辑技术较难实现大范围的基因编辑,极大地妨碍了丝状真菌的遗传学研究。CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein)技术的出现,打破了这一困境,促进了不同种属和不同来源的丝状真菌的基因编辑,为丝状真菌的基础和应用研究带来了革命性的突破。本文简述了CRISPR/Cas系统的作用机理、分类及基于CRISPR的各种新型技术,归纳总结了丝状真菌中现有的CRISPR/Cas9系统功能组分、多种新兴CRISPR/Cas技术在丝状真菌中的应用现状以及海洋真菌中的CRISPR/Cas技术的应用情况。最后,对CRISPR/Cas系统在丝状真菌中应用进展缓慢、编辑效率低和脱靶效应等问题以及针对这些问题的潜在解决方法进行总结和展望,以期为不同类型的丝状真菌基因编辑平台的构建提供参考。

CRISPR/Cas9介导的adeG基因敲除大肠杆菌细菌模型的建立

【目的】鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,AB)是引起医院内感染的重要条件致病菌之一,耐药性AB是目前防治的棘手问题。细菌外排泵是引起耐药性的重要原因之一,拟通过PCR检测鲍曼不动杆菌耐药结节分化家族(resistance-nodulation-division,RND)外排泵基因adeLFGH的分布,探索其与耐药性的关系;建立adeG耐药基因模型,利用CRISPR/Cas9系统对其进行靶向敲除的初步研究。【方法】运用肉汤微量稀释法检测耐药性分布;PCR筛查13株临床分离多重耐药鲍曼不动杆菌adeLFGH外排泵基因并分析其分布;扩增RND外排泵关键基因adeG并构建耐药细菌模型;设计特异性sgRNA,利用CRISPR/Cas9系统进行靶向敲除,药敏实验检测其敲除效果。【结果】13株临床鲍曼不动杆菌对多黏菌素E敏感,对左氧氟沙星耐药率较低,仅为38.5%,对头孢他啶的耐药率为92.3%,对妥布霉素耐药率为84.6%,对其他临床常见药物耐药率均为100%。13株多重耐药鲍曼不动杆菌adeLFGH携带率为100%。药敏实验结果显示adeG模型耐药菌株的哌拉西林、替卡西林/克拉维酸以及哌拉西林/他唑巴坦由敏感转为耐药,氯霉素、美罗培南、米诺环素由敏感转为中介。特异性sgRNA介导CRISPR/Cas9系统靶向敲除效率不同。pCas9-sgRNA1(adeG)靶向后哌拉西林/他唑巴坦的耐药性得到了逆转,对妥布霉素、四环素、多西环素、米诺环素的耐药性也有不同程度的降低;pCas9-sgRNA2(adeG)和pCas9-sgRNA3(adeG)使哌拉西林/他唑巴坦由耐药恢复到了中介,但对其他药物的耐药性逆转效果并不显著。【结论】特异性CRISPR/Cas9系统可以特异性敲除耐药基因,提示可为耐药菌的治疗提供新的思路和方法。

CRISPR/Cas9系统在畜禽遗传改良中研究进展

CRISPR/Cas9基因编辑技术作为一种高效的基因组编辑方法,在畜牧业遗传改良领域得到了广泛的应用。该技术以高效、精准的特点,为畜牧业发展带来了一场革命。目前,基于CRISPR/Cas9的基因敲除、基因敲入和基因修饰等已被广泛应用,实现了对畜禽物种的重要生产性状进行精准改良。本文介绍了CRISPR/Cas9技术的工作原理及发展历程,重点介绍了该技术在畜禽肌肉生长发育、绒毛纤维生长、乳品质成分、抗病育种以及动物福利中的研究进展,旨在为更深入地了解CRISPR/Cas9技术在畜禽基因编辑上的应用提供参考。

CRISPR/Cas12a技术在动物疫病检测方面的应用

CRISPR/Cas系统是由簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(Cas)组成的一种基因编辑技术,可以特异地切割和识别靶标核酸基因。该技术具有检测速度快、灵敏度高和特异性强的优势,因此被广泛应用于动物疫病检测领域。本文就CRISPR/Cas12a结合等温核酸扩增技术和可视化技术在动物疫病检测中的应用进行综述,并对其应用前景进行展望,以期为我国的养殖业和进境动物疫病的监测提供技术支撑。

通过CRISPR/Cas9建立豌豆基因组大片段敲除体系

豌豆是世界上主要食用豆类作物之一,因其丰富的营养价值和良好的生态价值而受到越来越多的重视。CRISPR/Cas9作为一种生物育种的新型技术手段,已广泛应用于各种作物的品种改良中,但在豌豆中的应用报道非常少见。本研究以“中豌6号”品种为试验材料,采用CRISPR/Cas9技术手段成功地实现了豌豆基因组中Psat01G0240600-T1、Psat03G0303300-T1和Psat03G0304700-T1基因的大片段缺失,其大片段敲除效率分别是24.1%、13.0%和3.6%。进一步对结果分析发现,不同靶点的编辑效率相差较大,并且大片段缺失的效率取决于2个靶点中较低编辑效率的靶点。本研究利用发状根体系探索了CRISPR/Cas9在豌豆中的应用,首次在豌豆中实现了大片段敲除,对于豌豆的研究具有重要意义。