不同规格熟地黄蒸法炮制工艺优化研究

目的:探究不同规格熟地黄采用常压蒸制与高压蒸制方法进行炮制后对其品质的影响,明确其炮制工艺参数,获得熟地黄最佳炮制工艺。方法:地黄药材按不同规格进行分类,经过常压蒸制与高压蒸制,研究不同压力、不同时间、不同温度下饮片炮制的影响,以外观性状、浸出物和地黄苷D(C_(27)H_(42)O_(20))三项为评价指标,探究熟地黄最优炮制工艺。结果:采用常压蒸制工艺,设定温度100℃,一级样品蒸制7小时;二级样品蒸制4.5小时;三级样品蒸制4小时。结论:熟地黄采用常压蒸制优于高压蒸制炮制方法,不同级别地黄选用不同蒸制时间更能获得高质量的炮制品。

熟地黄清蒸和九蒸九晒炮制品中还原糖含量测定

目的:考察地黄清蒸和九蒸九晒炮制品中还原糖含量变化规律。方法:用80%甲醇溶液回流提取,全自动还原糖测定仪测定熟地黄样品中还原糖含量。结果:还原糖在0.002g～0.012g(r=0.9999)有良好的线性关系;平均回收率为100.6%(RSD1.31%),重复性RSD0.74%。结论:地黄在清蒸和九蒸九晒过程中,还原糖含量在一定时间和蒸晒次数范围内随着蒸制时间的延长和蒸晒次数的增多而增加。

九蒸九晒熟地黄多糖影响Lewis肺癌荷瘤小鼠细胞凋亡发生机制的研究

目的:探讨九蒸九晒熟地黄多糖(RGP)对Lewis肺癌细胞凋亡的作用机制,为临床治疗提供实验依据。方法:建立Lewis肺癌小鼠模型,给予不同剂量RGP,给药3 w,利用流式细胞术检测凋亡;Western blot检测凋亡蛋白;ELISA检测免疫指标。体外实验RGP以不同浓度作用于Lewis肺癌细胞。流式细胞术检测细胞凋亡;MTT法检测细胞增殖;荧光染色检测线粒体膜电位;Western blot检测凋亡蛋白。结果:动物实验中,与模型组比较,RGP组的凋亡指数、凋亡蛋白(Bax、Caspase)表达以及免疫指标均显著升高(P<0.01),Bcl-2表达显著降低(P<0.01),且呈剂量依赖性。细胞实验中,RGP组细胞凋亡率、凋亡蛋白(Bax、Caspase)表达显著升高(P<0.01);肺癌细胞增殖减少;线粒体膜电位降低,Bcl-2表达显著降低(P<0.01),且呈浓度依赖性。结论:RGP可抑制Lewis肺癌细胞增殖,促进凋亡,这一系列反应可能与诱发凋亡蛋白和增强免疫应答有关。

熟地黄炮制工艺及质量标准的探讨

目前以熟地黄为代表的中药,其炮制是否需要"九蒸九晒",在行业内一直没有定论。纵观本草文献,熟地黄的炮制往往需要"反复蒸晒",而现代工艺简化为"一步到位",这两者之间能否等效?作为典型的"生泻熟补"中药,熟地黄炮制前后性状、功效差异较大,这种差异必定与炮制工艺息息相关,而熟地黄现行质量标准无法体现差异性。为此,本文整理历代本草著作,收载有关熟地黄炮制方法,对比现行质量标准及相关研究,探讨熟地黄炮制工艺改进的可行性以及其质量标准存在的问题,以期为建立更科学的炮制工艺和质量标准提供思考与借鉴。

基于顶空-气相色谱-离子迁移谱法的地黄与酒炖熟地黄及蒸制熟地黄挥发性化学成分表征及差异性研究

目的比较地黄炮制前后及不同炮制加工方法炮制品中挥发性成分的差异。方法采用顶空-气相色谱-离子迁移谱(HS-GC-IMS)对地黄生品及其炮制品酒炖熟地黄和蒸制熟地黄的挥发性成分进行检测并比较成分变化,结合主成分分析(principal component analysis,PCA)和“最近邻”指纹分析其挥发性成分的差异。结果GC-IMS指纹图谱显示地黄生品和炮制品的挥发性成分存在差异,且不同炮制方法所得酒炖熟地黄与蒸制熟地黄挥发性成分也存在明显差异。共鉴定挥发性成分90个;明确了地黄炮制前后的特征性变化成分,以及酒炖熟地黄与蒸制熟地黄的差异性成分,酒炖熟地黄中2-甲基丙酸、丁酸、2-甲基丙醛、乳酸乙酯、β-蒎烯、乙醇、1-丙醇、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醇、1-己醇、2-戊基呋喃等物质的含量较高;而蒸制熟地黄中E-2-戊烯醛、噻吩、2-甲基吡嗪、2-戊酮、环己酮、4-甲基-2-戊酮、4-甲基-3-戊烯-2-酮、乙酸异丙酯等物质的含量较高。PCA和“最近邻”指纹分析结果显示,生地黄与其炮制品及酒炖熟地黄与蒸制熟地黄间分离度良好。结论地黄加工炮制前后其挥发性成分发生了较大的变化,研究结果可为地黄生品和炮制品的辨识提供一定的思路,为熟地黄饮片的质量控制和临床应用提供参考。

六味地黄丸定量分析方法和评价体系的建立

目的:建立六味地黄丸14种成分含量测定方法,并应用评分体系对各厂家样品进行评价。方法:建立超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法(UPLC-QqQ-MS/MS)对市售12个厂家、4种剂型共109批六味地黄丸样品中尿囊素、没食子酸、地黄苷D、獐牙菜苷、芍药苷等14种成分进行定量分析;同时,参照2020年版《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)中六味地黄丸含量检测项下方法对莫诺苷、马钱苷、丹皮酚进行定量,根据不同剂型和厂家进行含量分布考察。将各成分(除5-羟甲基糠醛)按含量排名、药味归属及药味的君臣佐使进行赋值,对各厂家样品进行综合评价。结果:建立的六味地黄丸14种成分含量测定方法,各成分在其质量浓度范围内线性关系良好,专属性、重复性、耐用性、准确度良好。评价结果显示,大蜜丸厂家山西B厂和广东E厂基本全部批次为优等,大蜜丸广西D厂、水蜜丸云南I厂、小蜜丸湖南J厂、水丸吉林K厂几乎全部低于70分。大蜜丸B厂和E厂整体质量较好,前者体现在归属熟地黄、泽泻、酒萸肉、茯苓的成分含量较高,后者则在泽泻和熟地黄归属成分上占优。湖南J厂、广西D厂归属熟地黄和泽泻的成分评分较低,提示厂家应重视这2味药材投料的品质,云南I厂归属熟地黄、牡丹皮的有效成分含量低,投料的牡丹皮同时还存在硫熏情况。结论:建立的六味地黄丸定量分析方法和评价体系能直观、系统地区分厂家样品优劣,提示厂家对于现行版《中国药典》中未进行含量监控的药味特别是熟地黄、泽泻,应引起重视,同时需关注投料牡丹皮的硫熏问题。

熟地黄炮制(九蒸九晒)过程中药效化学成分量变化及炮制辅料对其影响研究

目的基于HPLC法探讨炮制辅料黄酒对九蒸九晒制备得到的熟地黄的化学成分动态变化的影响差异性。方法色谱柱为Hypersil GOLD a Q C_(18)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),体积流量为1 m L/min,柱温为25℃。梓醇定量测定:流动相为乙腈-0.1%磷酸水(1∶99),检测波长为210 nm;地黄苷A定量测定:流动相为乙腈-0.1%磷酸水(3∶97),检测波长为203 nm;地黄苷D和益母草苷定量测定:流动相为乙腈-0.1%磷酸水(4∶96),检测波长为203 nm;毛蕊花糖苷定量测定:流动相为乙腈-0.1%磷酸水(16∶84),检测波长为334 nm;5-羟甲基糠醛(5-HMF)定量测定:流动相为乙腈-0.1%磷酸水(11∶89),检测波长为284 nm。糖类成分的测定:色谱柱为Accurasil NH2柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-水(72∶28),体积流量为1 m L/min,柱温25℃,检测器为ELSD,Alltech2000ES,漂移管温度93℃,气体体积流量2.6 L/min。采用SPSS 20.0进行统计分析,将清蒸-九蒸九晒与酒蒸-九蒸九晒制得的不同蒸晒次数的熟地黄中12种化学成分定量测定数据进行配对样本t-检验。结果随蒸晒次数的增加,清蒸法与酒蒸法制得熟地黄中梓醇及益母草苷、毛蕊花糖苷、水苏糖、蔗糖、棉子糖均减少;地黄苷A及地黄苷D略为增加;5-HMF、果糖、葡萄糖、甘露三糖均增加。结论建立的方法符合方法学验证要求。在古法熟地黄九蒸九晒的炮制过程中,炮制辅料黄酒对炮制品的质量存在显著影响,且清蒸法与酒蒸法均以第3次、第4次及第6次蒸晒所得熟地黄的相关物质的量呈较大的波动性。

基于蛋白质组学探讨九蒸九晒地黄延缓去卵巢小鼠脑衰老的药效与机制

探究九蒸九晒地黄延缓去卵巢小鼠脑衰老的药效与机制。小鼠去卵巢之后随机分成模型组、戊酸雌二醇组(0.3 mg·kg^(-1))以及九蒸九晒地黄低、中、高剂量组(1.0、2.0、4.0 g·kg^(-1)),另设假手术组,每组15只。术后1周,开始灌胃给药连续15周。跳台实验和水迷宫实验检测小鼠行为学变化。HE染色和尼式染色观察小鼠脑组织形态学变化。免疫组化检测小鼠脑组织Aβ和ER_(β)的表达。试剂盒检测小鼠血清雌激素水平和脑组织胆碱酯酶及胆碱酯酶转移酶水平。提取海马蛋白,Nano-ESI-LC-MS联用系统检测蛋白,Protein Discovery软件鉴定蛋白,SIEVE软件进行蛋白相对定量定性分析,PANTHER Classification System数据库对差异蛋白进行GO分析和KEGG数据库信号通路富集。与假手术组比较,模型组学习记忆能力下降,跳台潜伏期显著缩短(P<0.05),Morris水迷宫实验中,逃避潜伏期显著延长(P<0.05),穿越平台次数和目标象限停留时间缩短;海马区神经细胞排列散乱,细胞间隙变大,Aβ阳性细胞表达显著增多(P<0.05),ER_(β)阳性细胞表达显著减少(P<0.05),雌激素水平明显下降(P<0.05),胆碱功能减退(P<0.05)。与模型组相比,九蒸九晒地黄组学习记忆能力改善,跳台潜伏期显著延长,雌激素水平明显升高(P<0.05),海马区神经细胞排列整齐,形态完整,Aβ阳性细胞数量减少,ER_(β)阳性细胞表达增多。蛋白质组学筛选差异蛋白得到146个,KEGG信号通路富集分析得到75条信号通路,其中参与dopaminergic synapse信号通路的蛋白最多,有13个蛋白参与。综上,九蒸九晒地黄可延缓去卵巢小鼠脑衰老进程,其机制可能为提高雌激素水平,介导dopaminergic synapse信号通路,提高胆碱功能。

整合糖组与代谢组学方法比较蒸制和酒炖熟地黄化学成分

目的对《中国药典》收载的蒸制和酒炖2种炮制法所得熟地黄的化学成分进行比较研究。方法整合基于HPLC(C18)-PDA、HPLC(NH2)-ELSD和高效凝胶渗透色谱(HPGPC)-ELSD的糖组学和基于UPLC-QTOF-MS/MS的代谢组学方法,对2种熟地黄的糖类组分(多糖、寡糖和游离单糖)和非糖小分子组分进行分析比较。结果与蒸制地黄相比,酒炖地黄多糖相对分子质量范围更宽,较大相对分子质量多糖占比较高。2种熟地黄多糖均由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成,但其物质的量比稍有不同(2.57∶0.05∶1.00∶0.87∶0.10vs2.07∶0.07∶1.00∶1.05∶0.17)。2种熟地黄均含有寡糖水苏糖、甘露三糖和蜜二糖,但酒炖地黄中水苏糖含量显著高于蒸制地黄(P<0.01)。2种熟地黄均含有游离单糖葡萄糖、果糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖,但酒炖地黄中葡萄糖(P<0.01)、鼠李糖(P<0.05)和甘露糖(P<0.05)含量均显著低于蒸制地黄,而半乳糖含量显著高于蒸制地黄(P<0.05)。2种熟地黄中共筛选到29个差异性非糖小分子成分,主要为环烯醚萜苷类、苯乙醇苷类和呋喃醛衍生物。代表性成分定量分析表明,与蒸制地黄相比,酒炖地黄中梓醇、益母草苷和地黄苷D含量较高(P<0.01),密力特苷(P<0.05)和5-羟甲基糠醛(P<0.01)含量较低。结论蒸制和酒炖地黄内在质量存在显著差异,这种内在质量差异是否会显著影响其药效仍有待深入研究。

基于双波长高效液相色谱法同时测定九蒸九晒熟地黄中7种成分的含量

目的 建立同时测定九蒸九晒熟地黄中梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异类叶升麻苷、5-羟甲基糠醛(5-HMF)等7种成分含量的方法。方法 采用超声法提取九蒸九晒熟地黄炮制过程中每一次蒸晒后的样品,然后应用高效液相色谱(HPLC)法同时测定样品中7种成分的含量;色谱柱为赛默飞C18(250.0 mm×4.6 mm,5μm),流动相为0.1%磷酸(A)-乙腈(B),梯度洗脱,柱温30℃,检测波长203,332 nm,进样量10μL。结果 7种成分在各自线性范围内线性关系良好,平均加样回收率为97.57%~100.58%,RSD为0.60%~1.78%。结论 该方法准确、稳定,重复性好,可用于九蒸九晒熟地黄饮片的质量控制。