布鲁氏菌的Rep-PCR分型研究

目的探索对布鲁氏菌属的分子生物学分类方法。方法应用Rep-PCR进行分型研究,以布鲁氏菌属各种型代表菌株为参考,将该方法对国内分离的典型、非典型布鲁氏菌菌株、疫苗菌株进行分类研究。结果使用Rep-PCR方法,不仅在属的水平上可以检测、鉴定布鲁氏菌属,而且能够将107株国内外布鲁氏菌的参考菌株和地方流行菌株分为8个组。结论使用Rep-PCR方法可以对布鲁氏菌株进行分型,将典型和非典型布鲁氏菌进行鉴定和分型,弥补传统分类方法的不足。

沈阳市副溶血弧菌重复序列PCR分型

目的探讨重复序列PCR对临床分离株副溶血弧菌进行分型的可行性;从分子水平了解沈阳市流行的副溶血弧菌菌型特征。方法利用基因外重复回文序列-PCR(PEP-PCR)和肠细菌基因间共有重复序列-PCR(ERIC-PCR)对40株临床分离副溶血弧菌基因组DNA进行扩增,对扩增的DNA电泳指纹图谱进行分型分析。结果40株副溶血弧菌呈现不同程度的基因多态性。基因外重复回文序列-PCR分辨力指数可达到0.953,40株菌株分为16个型,优势菌型为G型,占总菌数的20.0%。肠细菌基因间共有重复序列-PCR分辨力指数为0.5;40株菌株可分为4个型,优势菌型为D型,占总菌数的67.5%。结论重复序列PCR可以用于副溶血弧菌临床分离株的分子分型研究,其分型敏感程度优于血型分型。

细菌基因组重复序列PCR技术及其应用

细菌中散在分布的DNA重复序列近年来不断被报道,基因外重复回文序列和肠细菌基因间共有重复序列是两个典型的原核细胞基因组散在重复序列。重复序列在染色体上的分布和拷贝数具种间特异性,用它们的互补序列作为引物,以细菌基因组DNA为模板进行PCR扩增反应,反应产物的琼脂糖电泳可以提供非常清晰的DNA指纹图谱,使用此图谱既可对各种微生物进行快速分型及鉴定,又可对它们进行DNA水平上的遗传多样性分析。细菌基因组重复序列PCR技术具有简捷、快速、结果稳定等特点,可对细菌进行分子标记,用于菌株分型、分类鉴定和亲缘关系等方面的研究。

REP-PCR及ERIC-PCR法对分离自海产品副溶血性弧菌分型分析

目的:采用细菌基因外重复回文序列扩增(REP-PCR)和肠道细菌基因间重复序列扩增(ERIC-PCR)两种方法对副溶血性弧菌2株标准株,13株实验室保存菌株和73株分离菌株共88株进行分子分型。方法:通过REP和ERIC-PCR指纹图谱扩增,利用NTsys-pc软件采用Dice系数对指纹图谱进行聚类结果分析。结果:所有供试菌株可通过此两种方法进行分型得到清晰的指纹图谱,并反映出副溶血性弧菌具有丰富的遗传多样性,REP-PCR扩增出5～9条分布在609～4200bp之间的条带,可将副溶血性弧菌分为5个群12类型,分辨指数达0.93,其中tdh+株在相似系数0.86时可聚类在第Ⅰ群;ERIC-PCR扩增出5～11条分布在400～7593bp之间的条带,将副溶血性弧菌分为7个群11个类型,分辨指数为0.94,其中tdh+株在相似系数0.76时可聚类在第Ⅰ群。结论:两种方法均显现出很好的分型能力,能够很好地将环境分离tdh+菌株和标准菌株聚类在一起,其中REP-PCR较ERIC-PCR重复性更好。

中国弓形虫虫株529bp重复序列的PCR扩增、克隆及分析

【目的】首次对中国来源于不同宿主、不同地域的9个弓形虫虫株(ZS1人株、PY猪株、GY猪株、ZC猪株、NT猪株、ZS人株、SH人株、CN猪株、QHO绵羊株)以及国际标准强毒RH株之间在529bp重复序列的变异进行研究,从而为进一步的分子诊断和分子遗传学研究以及弓形虫病的防制奠定基础。【方法】抽提基因组DNA后,用PCR方法对10个虫株的529bp重复序列进行扩增;扩增产物经纯化后克隆于pGEM-TEasy质粒载体,再经菌落PCR及酶切鉴定阳性克隆,然后对阳性克隆进行测序及序列分析。【结果】10个弓形虫虫株的529bp重复序列都不完全相同,它们之间的核苷酸序列变异范围为0.8%～2.9%。变异主要位于第32～55位碱基之间,这些碱基变异与虫株的宿主来源、地域来源及毒力之间没有相关性。【结论】529bp重复序列可作为遗传标记,用于弓形虫与其它寄生虫的种间鉴定,但不适合用于研究弓形虫的种内遗传变异。

ERIC-PCR技术在李斯特氏菌种、菌株鉴定中的应用

应用肠杆菌基因间重复一致序列聚合酶链反应技术(ERIC-PCR)对李斯特氏菌基因组DNA进行分析,结果显示,李斯特氏菌种间DNA指纹图谱带型差异较大;单核细胞增生性李斯特氏菌株间及相同血清型不同来源的菌株,其DNA指纹图谱带型也有明显差异。在单核细胞增生性李斯特氏菌各株的DNA指纹图谱中发现1600bp的种专一性扩增带。结果表明,ERIC-PCR技术可用于李斯特氏菌种、菌株的鉴定及进一步分型研究。

通过PCR技术简单扩增奶牛高GC含量的rDNA重复序列

为了探索利用PCR简单扩增高GC含量的长重复序列的方法,经反复摸索后选用LAPCR法即LAPCRTaq酶结合GC缓冲液Ⅱ来扩增奶牛高GC含量的长片段重复序列,成功获得了全长2538bp,GC含量为65.7%的DNA序列,其中ITS1的GC含量高达80%.探索了克隆复杂DNA序列时引物设计的特别规则、反应体系的改进、DNA聚合酶的选用等措施.

副溶血性弧菌重复序列-PCR分型研究

利用基因外重复回文序列-PCR(REP-PCR)和肠细菌基因间共有重复序列-PCR(ERIC-PCR)技术,对副溶血性弧菌进行了分子分型研究和亲缘关系的探讨,并使用Hunter和Gaston方法计算分辨力指数。结果显示40株副溶血性弧菌分离株均可扩增产生可重复的DNA指纹图谱,并且不同菌株基因组DNA的扩增条带具有多态性。根据SPSS10.0软件得出的树状图结果,REP-PCR可以把40株菌分为21个型,分辨力指数可达到0.953,优势菌型为G1型;ERIC-PCR可将40株菌分成4个型,分辨力指数为0.5。研究显示重复序列-PCR方法可以用于该菌分型分析,REP-PCR具有较好的分型能力。在两种PCR的DNA指纹图谱中,血清型O1群与O3群主条带均非常相似,表明它们之间亲缘关系密切。

食源性单核增生李斯特氏菌重复序列-PCR分型与鉴定研究

目的探索我国北方部分省市单核增生李斯特氏菌食品分离株与标准菌株间的亲缘关系,筛选食品中该菌的鉴定用标识序列。方法利用REP-PCR和ERIC-PCR技术,对单核增生李斯特氏菌的基因组进行分型研究,并以相似性系数构建进化树。回收、克隆该菌共有的ERIC-PCR扩增DNA条带,通过序列测定、BLAST分析及PCR验证,确定使用该序列鉴定该菌的可行性。结果本研究所用的单核增生李斯特氏菌分别被ERIC-PCR和REP-PCR扩增产生约1 800bp的共有扩增带;当欧式距离的平方为20时,ERIC-PCR和REP-PCR均将25株菌分为3个群,当欧式距离的平方为5时,ERIC-PCR将25株菌分为16个型,REP-PCR将25株菌分为20个型。ERIC-PCR得到的1 800bp共有扩增片段测序后的长度为1 816bp,为李斯特氏菌属共有的精氨酸生物合成双功能argJ基因。结论重复序列-PCR可将本研究的单核增生李斯特氏菌食品分离株分为3个群;筛选获得的ERIC-PCR特异DNA扩增片段可用于李斯特氏菌属的鉴定。

米醋沉淀中Bacillus subtilis DNA提取及ERIC-PCR体系条件优化

利用稀释平板法从米醋沉淀中分离获得细菌,通过对其进行16S rDNA分子鉴定,表明该细菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。以该菌为实验材料,研究了细菌基因组DNA的提取方法,并将ERIC-PCR法首次应用于醋液菌种,对此反应体系的主要因素进行了优化,最终建立了适合于本实验室的ERIC-PCR体系。结果表明,采用改良的传统细菌基因组DNA提取方法,所提取的DNA质量较高,能够满足ERIC-PCR反应的需要;建立的反应体系为:25μL反应体积10×扩增缓冲液(含Mg2+)2.5μL,20pmol/μLERIC-PCR引物E11.0μL,20pmol/μLERIC-PCR引物E21.0μL,DNA模板2μL,2.5mmol/LdNTPs混合液1.6μL,taq聚合酶0.9μL,双蒸水补齐;PCR反应程序为:94℃变性4min,1个循环;94℃变性30s,58℃退火40s,72℃延伸1min,30个循环;72℃延伸4min。

链霉菌的rep-PCR基因指纹分析

对重复片段PCR(rep PCR)基因指纹分析应用于链霉菌分子分型进行研究 ,结果表明rep PCR基因指纹分析具有分辨率高、稳定、重现性好、简便易行等特点 ,在一定程度上与 1 6SrDNA序列比较结果相一致 ,是一种快速而有效的DNA指纹技术 ,能反映出链霉菌种和菌株水平的基因型、系统发育和分类学关系 ,可应用于种及以下水平的分类和快速鉴定 。

鸡产气荚膜梭菌遗传多样性的REP-PCR分析

为探讨鸡产气荚膜梭菌流行现状的调查方法,采用REP-PCR(repetitive extragenic palindromicPCR)技术对四川省10个规模化鸡场分离得到的34株A型产气荚膜梭菌进行了遗传多样性分析,并与AFLP(amplified fragment length polymorphism)方法进行了分型比较。结果显示,尽管REP-PCR分型方法只能将34株产气荚膜梭菌分为7个亚型,但是,仍然表现出对产气荚膜梭菌菌株的较高的鉴别能力,不失为一种简便、快速、可靠的产气荚膜梭菌分型方法。经对亚型分布情况进行分析,表明产气荚膜梭菌的流行特点与地区差异相关,不同鸡场产气荚膜梭菌的亚型差异明显,而同一鸡场的亚型较单一,以一种亚型为主,交叉有少数其他亚型;优势基因型为REP-PCR基因1型、2型和3型。证实,REP-PCR技术适用于鸡产气荚膜梭菌遗传多样性分析。

重复片段PCR检测葡萄球菌DNA指纹在医院感染中的分析

目的 应用重复片段PCR ,对凝固酶阴性葡萄球菌 (CNS)进行基因分型 ,用于医院感染中分子流行病学研究。方法 选择REP1+REP2和ERIC1+ERIC2两对引物 ,对临床分离的 6 8株 (CNS)菌株进行重复片段PCR ,根据扩增产物的电泳模式编制菌株间的相似矩阵 ,并利用RAPD、PHYLIP及TREEVIEW等软件 ,绘制各株间的遗传聚类图。结果 两对引物的扩增带型均比较丰富 ,对于实验CNS菌株具有较好的分辨率 ,根据聚类结果 ,可以确定某些菌株之间的同源性 ,为感染源的确认等分子流行病学研究提供依据。结论 重复片段PCR分辨率高 ,根据聚类结果确定菌株的同源性 ,为医院感染确认感染源提供了分子流行病学的依据。

沙门菌基因间共有重复序列-PCR分子分型方法的优化及应用初探

目的优化沙门菌基因间共有重复序列-PCR(ERIC-PCR)分子分型方法,分析沙门菌标准菌株及流行分离株基因组DNA ERIC-PCR指纹图谱。方法提取鼠伤寒沙门菌基因组DNA作为模板,根据ERIC核心片段设计引物,运用ERIC-PCR技术扩增沙门菌基因组中的靶序列,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像分析仪对图谱进行观察分析。反应体系中模板量、Mg2+浓度、引物浓度和退火温度的优化实验则采用对优化项目设置梯度、其它条件不变的方法进行。以优化好的ERIC-PCR方法对16株沙门菌及1株大肠杆菌进行分析。结果在总体积为25μl的反应体系中,选择DNA模板量为100ng/25μl,Mg2+浓度为2.0mmol/L,引物ERIC1R、ERIC2浓度分别为0.4μmol/L,退火温度为52℃时,扩增产物的电泳图谱条带最清晰完整。不同血清群、型和来源的沙门菌株间基因组DNA ERIC-PCR指纹图谱带型差异较大,可在250～5000bp范围内出现3～13条条带,并在250bp处出现一条特征条带。结论优化了沙门菌ERIC-PCR的重要反应条件。ERIC-PCR法能区分不同来源的沙门菌,可用于沙门菌病的流行病学调查和同源性追踪,弥补传统分型方法的不足。

REP-PCR技术在光滑假丝酵母菌基因分型中的应用价值

目的评估重复序列PCR(REP-PCR)技术在光滑假丝酵母菌基因分型中的作用。方法收集深部真菌感染患者体内分离的光滑假丝酵母菌34株,以API 20C AUX酵母菌鉴定板条鉴定菌种及生化表型。采用REP-PCR对34株光滑假丝酵母菌进行基因分型:提取真菌基因组DNA,以Care-2重复元件设计引物,PCR扩增产物电泳后运用NTSYS软件进行聚类分析,聚类树状图相似系数(SI)≥97%且无明显条带差异定为同一基因型,SI≥97%且仅相差一条条带定为亚型。比较REP-PCR分型与多位点序列分型(MLST)的辨别力指数(DP),分析具有不同生化表型光滑假丝酵母菌的REP-PCR基因分型情况。结果 REP-PCR基因分型结果显示:34株光滑假丝酵母菌分为17个基因型,其中A型8株,B型6株,C、D型各3株,E型2株,F～Q型各1株,未发现亚型。REP-PCR和MLST基因分型的DP(95%CI)分别为0.911(0.770～0.980)和0.369(0.220～0.560),两者比较差异有统计学意义(χ2=21.68,P<0.01)。34株光滑假丝酵母菌有两种生化表型,生化表型代码分别为2000040(32株)和6000040(2株),生化表型代码为60000402的2株经REP-PCR分型结果分别为D型和K型(SI=0.43)。结论 REP-PCR对光滑假丝酵母菌基因分型的辨别力较强且操作简便,适用于临床实验室对光滑假丝酵母菌的流行病学研究。

医院感染MRSA的重复序列PCR分型研究

目的对引起医院感染的耐甲氧西林金葡菌(MRSA)进行分子流行病学调查。方法根据医院感染诊断标准,选择2008年我院MRSA医院感染患者30例和疑似医院感染患者5例,分离得到MRSA菌株36株。采用Diversilab自动化重复序列(REP)-PCR(repetitive-element sequence-based PCR)分型系统,研究MRSA菌株遗传特征和流行特点。结果 MRSA在我院的3个病房中存在6型REP-PCR指纹图。REP-Ⅰ型为优势分离株,占研究MRSA的64.86%,集中在西区急诊病房、西区呼吸病房和西区外科重症监护病房(SICU)。REP-Ⅲ型菌株全部分离自喉科术后感染患者。结论 REP-Ⅰ型菌株是我院西区MRSA感染的主要型别;MRSA在西区急诊病房的流行是此类医院感染在我院播散的重要环节;Diversilab自动化REP-PCR分型技术系统可成为医院感染病原研究的有效手段。

沙尘天气气载耐甲氧西林葡萄球菌监测及其REP-PCR指纹图谱分析

目的了解沙尘天气时空气中葡萄球菌浓度及气载MRSA的遗传多样性,为临床葡萄球菌病的防控提供科学依据。方法用LWC-1型离心式空气微生物采样器采集火车站、学校、公园、广场等场所空气并分离鉴定其中的葡萄球菌,采用REP-PCR扩增不同源MRSA的基因组DNA形成聚类图谱,分析不同源MRSA的相似性。结果气载金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌浓度沙尘天气时浓度均明显增高,与正常天气时的浓度差异有统计学意义(P<0.05);在火车站中最高,浓度分别为116.7CFU/m^3和162.0CFU/m^3。从空气中共分离得到金黄色葡萄球菌111株,其中MRSA20株;凝固酶阴性葡萄球菌179株,其中MRCNS共11株。20株气载MRSA图谱显示菌株相似性在48%~100%之间;气载MRSA与医院临床MRSA分离株之间的相似性在50%~100%之间;与动物源MRSA之间的相似性在40%~100%之间。结论沙尘天气空气中存在着多种葡萄球菌,而且空气中的部分MRSA株与医院临床分离株及动物源的MRSA有着较高的遗传相似性,应加强空气中葡萄球菌尤其是耐药葡萄球菌的监测及防控。

奶牛GPR109A基因SYBR GreenI实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立奶牛G蛋白偶联受体109A基因(GPR109A)的实时荧光定量PCR检测方法,为开展奶牛产后脂类代谢紊乱及酮病发生机理研究奠定基础。【方法】根据Gen Bank中奶牛GPR109A基因和β-actin基因(内参基因)的m RNA保守序列设计合成两对引物,以奶牛肝脏组织c DNA为模板,PCR扩增目的基因后与载体连接构建重组质粒,以SYBR Green I实时荧光定量PCR进行扩增,绘制标准曲线,并对其特异性、敏感性、重复性等进行检验。【结果】GPR109A基因和β-actin基因的实时荧光定量PCR标准曲线方程分别为y=-3.309x+10.92(R2=0.9985)和y=-3.289x+9.794(R2=0.9997),扩增效率分别为101.0%和100.0%。特异性试验结果显示,GPR109A基因和β-actin基因的溶解曲线峰单一,无引物二聚体和非特异性扩增产物生成;敏感性试验结果显示,线性扩增范围广,可检测到1.8×102个拷贝的GPR109A基因;重复性试验结果显示,各扩增反应的变异系数(CV)小于或等于1.7%。【结论】基于GPR109A基因建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复性好等特点,可用于牛源性GPR109A基因表达量的快速检测和定量分析。

鸭疫里默氏杆菌ERIC-PCR基因分型

为了解广东地区鸭疫里默氏杆菌的流行情况,采用经优化建立的ERIC-PCR分型方法对来自广东地区16个鸭场的48株鸭疫里默氏杆菌分离株进行基因分型。结果表明:用ERIC-PCR法可将48个分离株分为16个基因型。12个鸭场存在着两种或两种以上基因型的菌株,并且不同鸭场流行基因型不同,8型和11型是较为流行的菌株。该研究结果可为广东地区鸭疫里默氏杆菌病的免疫防治提供参考。

采用ERIC-PCR与PFGE分析鲍曼不动杆菌基因型和同源性并对比方法学差异

目的比较脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)与肠杆菌科基因间重复序列聚合酶链式反应(enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,ERICPCR)检测鲍曼不动杆菌同源性的结果差异。方法分别采用PFGE和ERIC-PCR对我院院内分离的43株鲍曼不动杆菌进行分型检测。结果 43株鲍曼不动杆菌通过PFGE分型得出:A型22株、B型10株、C型3株、D型4株、E型2株、F型1株、G型1株;通过ERIC-PCR得出7种型别:Ⅰ型22株、Ⅱ型10株、Ⅲ型3株、Ⅳ型2株、V型3株、Ⅵ型1株、Ⅶ型2株。2种方法结果相符率为76.8%。我院鲍曼不动杆菌存在克隆株传播。结论 ERIC-PCR操作简便、结果可靠,与PFGE结果一致性高,2种分型方法均适合作为医院进行病原菌流行病学调查的分型检测手段。