RARE介导的视黄酸可调控的IFN-α表达载体的构建与鉴定

目的构建一个含视黄酸反应元件 ( RARE)的 IFN- α表达载体 ,使其在真核细胞内的表达受视黄酸 ( RA)的诱导。方法运用 DNA重组技术构建含有 4个 RARE重复序列的 IFN- α真核表达载体 ( p RARE4 - IFN- α) ,经酶切、PCR鉴定和测序确认后 ,用脂质体转染法使其转染 HL- 60细胞 (人早幼粒白血病细胞系 )、Bcap- 3 7和 MCF- 7细胞 (人乳腺癌细胞系 ) ,RA处理后 ,RT- PCR分析 IFN- α m RNA水平 ,EL ISA检测培养细胞上清中 IFN- α含量。结果 p RARE4 - IFN- α转染的 HL- 60、Bcap- 3 7和 MCF- 7细胞 ,IFN- α分泌量为 16～ 2 4 ng/ ( m L· 10 6 )细胞 ,而经 RA处理 2 4 h,IFN- α表达水平可增加 8～ 13倍 ,但经 RA处理 2 4 h的细胞 ,换无 RA的新鲜培养基继续培养 2 4 h后 ,IFN- α表达水平又下降到 2 5～ 3 4 ng/ ( m L· 10 6 )细胞。结论带有 RARE的 IFN- α表达载体转染细胞后 ,外源性 IFN- α基因的表达受 RA的诱导。

响应面优化文冠果油基生物柴油制备工艺

为探究文冠果油在生物柴油产业中应用前景,以SO_(4)^(2-)/ZrO_(2)-CeO_(2)-杭锦2#土(SZCe-HJ)为催化剂,采用中心复合(CCD)实验设计方法,通过改变对生物柴油产率影响最大的四个因素:反应时间-X_(1)、醇油摩尔比比-X_(2)、催化剂用量-X_(3)和反应时间-X_(4),考察生物柴油产率-Y的变化,并对实验数据进行拟合,建立数学模型。研究结果表明:该模型能够准确估算SZCe-HJ催化文冠果油制备生物柴油的产率。醇油摩尔比达到8.21:1、催化剂用量达到2.66 wt.%、反应时间持续8.65 h,生物柴油产率最高将达到62.76%。

人真皮成纤维细胞β2RARE-RXR结合的研究

培养人真皮成纤维细胞 ,提取核蛋白 ,与 3 2 P标记的维甲酸反应元件β2 RARE- RXR结合 ,进行电泳迁移改变分析。发现未经全反式维甲酸 ( AT- RA)刺激的细胞 ,其核蛋白与β2 RARE形成复合体 ,经 AT-RA刺激细胞后 ,迅速诱导产生明显的复合体 。选择两组核蛋白 (对照组和 AT- RA刺激 4 h组 ) ,分别加入维甲类 X受体 ( RXR) α和 β抗体并孵 16h,再与 3 2 P 标记的 β2 RARE结合 ,进行电泳迁移改变分析 ,结果为RXRβ抗体可使这两组核蛋白产生新的上移复合体 SS,RXRα抗体则无此作用。这一结果表明 ,与 β2 RARE结合的核蛋白中含有 RXRβ,但不含 RXRα;提示 RXRβ可能参与了 RARβ2

维甲类X受体与维甲酸反应元件β_2RARE结合的研究

目的 :确定人真皮成纤维细胞中维甲类 X受体 ( RXR)与维甲酸反应元件 ( β2 RARE)的结合。方法 :培养成纤维细胞 ,反式维甲酸 ( At- RA)刺激细胞不同时段 ,抽提核蛋白 ,3 2 P标记β2 RARE作为探针 ,并加入 RXRα和β抗体 ,进行凝胶阻滞分析。结果 :对照组细胞核蛋白与β2 RARE形成复合体 ;At- RA刺激细胞后 ,迅速诱导产生明显的复合体 。选择两组核蛋白 (对照组和 At- RA刺激 4 h组 ) ,分别加入 RXRα和 β抗体 ,凝胶阻滞分析发现 RXRβ抗体可使这两组核蛋白产生新的上移复合体 SS,RXRα抗体则无此作用。结论 :RXRβ能与 β2 RARE结合 ,它们的结合不受 AT- RA的影响 ;提示 RXRβ可能是作为一辅助因子参与了 RARβ2

基于特定序列的长牡蛎视黄酸反应元件预测

视黄酸受体和核受体超家族中的大部分成员对细胞整个分化、增殖过程都具有调控功能。视黄酸受体结合配体后激活,通过结合靶基因启动子区特定的核苷酸序列调控靶基因表达。视黄酸受体结合序列是由核心序列[A/G]G[T/G]TCA间隔不同碱基构成的重复序列,称为视黄酸反应元件。为了实现对长牡蛎基因组中含有的视黄酸反应元件的快速筛选预测,本研究利用Perl工具编写了一个可以批量筛选视黄酸反应元件的脚本,并对长牡蛎基因组中启动子区域序列进行筛选预测,共筛选到412个启动子区含有视黄酸反应元件的基因。随后,将这些基因在各种数据库中比对分析,预测其参与的生物学过程及可能的生物学功能。结果显示,大部分基因与蛋白质结合、核苷酸结合、水解酶活性、蛋白激酶活性等功能有关。

前列腺特异性启动子rPB的改造及其载体质粒的构建和活性测定

目的 构建一个前列腺特异性的、可启动针对雄激素非依赖性前列腺癌的基因治疗的改良启动子并测定其活性。方法 选择前列腺特异性启动子rPB ,通过两次PCR对其进行改造,用维甲酸反应元件(RARE)替代雄激素反应元件(ARE)或直接插入RARE ,构建成为不同拷贝条件的rPB DR ,并与质粒连接。转染细胞后,进行荧光素酶活性测定。结果 通过电泳鉴定及基因测序,证实构建成功。结论 根据实验设计,构建出的rPB DR应具有在维甲酸的调控下,针对雄激素非依赖性前列腺癌特异性启动基因治疗的功能,现构建成功不同拷贝条件的rPB DR ,证实实验设计构想,同时通过活性测定比较各种拷贝条件的rPB DR启动子活性的优劣,为下一步与治疗基因的连接及功能测定奠定基础。

视黄酸和α-干扰素对带有视黄酸反应元件的LUC报告基因表达的调控作用

目的 探讨视黄酸 (Retinoicacid ,RA)通过视黄酸反应元件 (RARE)调控外源基因表达的可行性。方法 构建带有视黄酸受体 β(RARβ)基因增强子区域RARE的荧光素酶 (Luciferase ,LUC)报告基因表达载体 ,应用脂质体包裹RARE TK LUC和RARE3 TK LUC质粒 ,并转染HL 60细胞 ,48h后 ,用RA和 /或α 干扰素 (IFNα)处理不同时间 ,用LUC报告基因检测试剂盒分析LUC报告基因活性。结果 经RA处理不同时间后 ,RARE TK LUC和RARE3 TK LUC质粒转染细胞的LUC相对活性分别较未经处理的转染细胞增加 12～ 3 8和 2 0～ 85倍 ;单用IFNα处理转染细胞 ,对LUC的表达无明显的诱导作用 ;IFNα和RA联合处理 48、72h ,LUC相对活性比单用RA处理增加 60 %～ 70 %。结论 RA可调控带有RARE的LUC报告基因的表达 。

细胞内视黄酸信号传递系统

视黄酸对基因表达的调控与肿瘤细胞的分化、胚胎的发育以及疾病的发生关系密切．视黄酸的基因调控作用是通过视黄酸信号传递系统实现的．视黄酸信号传递系统包括视黄酸、细胞液视黄醇（酸）结合蛋白、视黄酸细胞核受体及视黄酸反应元件等．视黄酸信号传递系统自成一体系，在这一系列调控的级联反应中存在着多级反馈调控环节，而且该系统还与视黄酸配体以外的信号系统相联系．

稀土金属离子对梨形四膜虫的24小时生长影响

应用4种方法(细胞直接计数法、中性红试验、蛋白质及核酸含量测定),研究不同浓度稀土金属离子La^(3+)、Sm^(3+)、Y^(3+)、Gd^(3+)处理24h后,对梨形四膜虫(Tetrahymena pyriformis)的生长影响。结果表明。在低浓度时La^(3+)、Sm^(3+)、Y^(3+),对四膜虫具刺激生长的作用,随着浓度的升高,4种稀土金属离子均表现出毒性效应;高浓度时,抑制生长作用特别明显。计算La^(3+)、Sm^(3+)、Y^(3+)、Gd^(3+)的半数抑制浓度(IC_(50)),表明毒性大小顺序为:Gd^(3+)>Y^(3+)>Sm^(3+)>La^(3+)分析其他3种方法与细胞直接计数法的相关系数,发现蛋白质与核酸测定方法,比中性红试验的相关性要好。比较每一处理组的四膜虫细胞间(10~4)蛋白质和核酸含量表明,稀土离子在刺激浓度时主要表现为促进四膜虫的分裂,而抑制效应在相对较低浓度时仅表现为抑制生长,在较高浓度时生长分裂均受到抑制。

Involvement of chromatin and histone acetylation in the regulation of HIV-LTR by thyroid hormone receptor

The HIV-1 LTR controls the expression of HIV-1 viral genes and thus is critical for viral propagation and pathology. Numerous host factors have been shown to participate in the regulation of the LTR promoter. Among them is the thyroid hormone (T3) receptor (TR). TR has been shown to bind to the critical region of the promoter that contain the NFbB and Sp1 binding sites. Interestingly, earlier transient transfection studies in tissue culture cells have yielded contradicting conclusions on the role of TR in LTR regulation, likely due to the use of different cell types and/or lack of proper chromatin organization. Here, using the frog oocyte as a model system that allows replication-coupled chromatin assembly, mimicking that in somatic cells, we demonstrate that unliganded heterodimers of TR and RXR (9-cis retinoic acid receptor) repress LTR while the addition of T3 relieves the repression and further activates the promoter. More importantly, we show that chromatin and unliganded TR/RXR synergize to repress the promoter in a histone deacetylase-dependent manner.

干扰素诱导RIG-G基因表达调控机制研究

目的探讨α干扰素（interferon α,IFNα）调控维甲酸诱导基因（retinoic acid-inducedgene G,RIG-G）表达的分子机制。方法应用http：//www.gene-regulation.com网站提供的AliBaba2.1软件对RIG-G基因的启动子区域进行分析,并采用荧光素酶报告基因转染实验和凝胶电泳迁移实验检测RIG-G基因启动子的功能活性及其对IFNα的反应性。结果发现在RIG-G基因的启动子序列中包含2个保守的干扰素刺激反应元件（IFN-stimulated response elements,ISREs）。转录因子STAT1蛋白（signal transducer and activator of tran-scription1）能够与这两个反应元件ISREⅠ和ISREⅡ相互结合。此外,在HT1080细胞中,与空载pXP2报告基因相比,含有ISREⅠ和ISREⅡ的pXP2-A报告基因表现出很强的基础活性（1741.2±517.5）,且这种活性还可被IFNα增强3～4倍（5338.7±1226.9,P〈0.05）。而在STAT1缺陷的U3A细胞中,pXP2-A报告基因的活性则被明显消弱（从1741.2±517.5降到406.1±103.2,P〈0.05）,加入IFNα也不能使其加强,表明STAT1蛋白是ISREⅠ和ISREⅡ发挥活性所必需的。结论RIG-G基因启动子所包含的ISREs是IFNα诱导RIG-G基因表达的分子基础,RIG-G是一个受STAT1蛋白直接调控的靶基因,在IFNα的信号转导途径中发挥着重要的作用。

干扰素刺激反应元件Ⅰ/Ⅱ在维甲酸诱导基因G表达调控中的作用

目的 深入研究维甲酸诱导基因G（retinoic acid-induced gene G,RIG-G）启动子上所含的干扰素刺激反应元件（interferon-stimulated response elements,ISRE）对RIG-G基因表达的调控作用.方法 根据RIG-G基因启动子所包含的ISRE序列,利用定点突变技术分别构建野生型和位点突变型的报告基因质粒,然后采用报告基因转染实验检测RIG-G基因启动子中ISRE序列的功能活性.结果 研究发现单独突变RIG-G基因启动子上的ISRE Ⅱ元件不影响报告基因的表达,而单独突变ISRE Ⅰ则会对报告基因的表达产生明显的抑制作用;同时突变ISRE Ⅰ和ISRE Ⅱ元件则会使报告基因完全失去对转录因子的反应性.结论 RIG-G基因启动子所包含的ISRE Ⅰ和ISRE Ⅱ元件是诱导该基因表达的转录因子复合物的作用位点,是该基因表达的分子基础,且ISRE Ⅰ元件的作用要优先于ISRE Ⅱ.