‘琯溪蜜柚’荧光定量PCR内参基因的筛选

【目的】为了克隆‘琯溪蜜柚’的管家基因,并筛选合适的管家基因作为内参,【方法】以‘琯溪蜜柚’盛花期后5个不同时期的果实汁胞,以及根﹑茎﹑叶为材料,采用实时荧光定量PCR技术,分析actin1﹑β-tubulin﹑18S rRNA﹑EF1-α和Ubiquitin 5个管家基因在不同材料中的表达情况,并结合geNorm、NormFinder﹑comparative Delta-CT和BestKeeper 4种评估方法进行稳定性分析。【结果】结果表明,actin1和β-tubulin是‘琯溪蜜柚’果实发育进程中较为稳定的内参基因,而EF1-α和β-tubulin则是研究不同组织特定靶基因表达中稳定的内参基因。【结论】筛选出了‘琯溪蜜柚’最佳的内参基因β-tubulin,为今后目的基因的表达分析奠定了基础。

采用荧光定量PCR溶解曲线法监测人TCR alpha链CDR3谱系漂移技术的初步探讨

目的:初步探讨荧光定量PCR溶解曲线分析技术监测人外周血T细胞TCRalpha链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。方法:提取4例正常人、2例淋巴瘤型白血病患者PBMC中的总RNA,逆转录成cDNA,以32个人TCRalpha链胚系可变区基因家族(TRAV)设计上游引物,共同的TCRalpha胚系链恒定区基因家族(TRAC)设计下游引物,荧光定量PCR(FQ-PCR)扩增32个TRAV基因各家族CDR3谱系,溶解曲线法分析各家族CDR3谱系的单/寡/多克隆增生。结果:正常人外周血T细胞TCRalpha链32个家族CDR3表达频率不一致,各家族PCR产物的溶解曲线谱型图(melting curve spectratyping)呈现熔点不同的CDR3多态性,为多克隆增生的高斯分布,2例淋巴瘤型白血病患者外周血T细胞TCRalpha链32个家族CDR3表达频率不一致,部分家族呈缺失状态,患者各家族PCR产物的溶解曲线谱型图上,多数家族为多克隆增生的高斯分布,但每个患者均出现数量不等的单克隆和寡克隆增生家族。结论:荧光定量PCR溶解曲线分析TCRalpha链CDR3谱系漂移技术方法稳定简便,能较好地监测正常人和临床样本外周血T细胞TCRalpha链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。

实时荧光RT-PCR在SARS病毒定量检测中的应用

目的建立实时荧光定量PCR技术检测患者SARS病毒含量。方法通过高效样品处理方法提取血清、漱口液中SARS-CoV RNA,采用简巢式PCR和TaqMan荧光探针标记技术检测SARS-CoV核酸,阳性扩增产物制备重组质粒,重组质粒系列稀释后标定作为定量标准曲线。结果本法具有很好的特异性、重复性,灵敏度达到1×105copies/L。132例漱口液标本中,40例SARS患者SARS-CoV核酸的检出率为65%(26/40),疑似病人检出率为11.5%(6/52),40例健康人均未检出;39例SARS患者的血清标本中SARS-CoV核酸检出率为25.6%(10/39),3例疑似病人血清均未检出。对52例疑似病人漱口液阳性的6例样本的基因扩增产物进行测序确认,与BJ01 AY278488标准序列一致,检测结果与临床表现基本相符。结论本法快速、特异,适用于临床样本中SARS冠状病毒的检测,同时为滴度低、取样困难的病原体的检测探索了一种新的方法。

樱桃病毒A实时荧光定量PCR检测技术的建立与应用

在樱桃病毒A(CVA)mp基因保守区域设计了3对检测引物,经特异性筛选后,获得可用于病毒定量研究的引物。制备质粒标准品,建立标准曲线,同时验证该方法的灵敏度和特异性,并应用于田间果树样品CVA定量检测。最终成功筛选出1对检测效率高、特异性强的引物(CVA-dF2、CVA-dR2),基于SYBR Green I荧光染料建立反转录实时荧光定量PCR检测CVA的方法。该方法重复性好、灵敏度高,无需借助内参基因即可准确检测目的病毒载量,绝对定量标准曲线斜率为-3.5746,决定系数R2为0.9986,扩增效率为0.9044,比常规RT-PCR检测灵敏度高10倍。该方法的建立为CVA定量研究提供了有力工具,可用于果树中CVA批量检测或低丰度病毒样品检测。

不同途径感染禽网状内皮组织增殖病病毒的动态监测

为明确鸡群经不同途径感染禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的排毒动态,本试验通过设立无特定病原体(SPF)鸡胚6胚龄卵黄囊感染组、1日龄SPF鸡腹腔感染组以及对上述两组SPF鸡分别加入感染鸡的卵黄囊感染同居组和腹腔感染同居组,建立SPF鸡感染REV模型,同时设置空白对照组,在不同日龄记录各组鸡的体重和死亡情况,并综合运用反转录PCR(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和间接免疫荧光试验(IFA)3种检测方法对各感染组进行REV的动态监测。结果显示:(1)与空白对照组相比,腹腔感染组和卵黄囊感染组SPF鸡体重增长在感染后第21~70天均受到显著抑制(P<0.05),卵黄囊感染组SPF鸡的死亡率在感染后第49和63天显著升高(P<0.05),腹腔感染组SPF鸡的死亡率在感染后第42天显著升高(P<0.05),卵黄囊感染组SPF鸡血浆中REV病毒载量在感染后第21天显著高于腹腔感染组(P<0.05);(2)卵黄囊感染组SPF鸡自出壳即可检测到病毒血症阳性,并在感染后第21天时达到排毒高峰,腹腔感染组SPF鸡在感染后第14天时达到排毒高峰;(3)卵黄囊感染同居组的10只SPF鸡在感染后第7天时即检测到2只鸡呈病毒血症阳性,腹腔感染同居组SPF鸡在感染后第21天时检测到1只鸡呈阳性;(4)3种检测方法中,RT-qPCR和IFA检出REV效果更好。本试验通过分析不同途径感染REV后鸡群血浆中的带毒状态,为REV感染的科学防控和净化提供参考数据。

实时荧光定量检测HCV RNA含量的临床意义

目的:建立实时荧光定量RT-PCR(RFQ-RT-PCR)检测HCV RNA含量的方法,初步探讨HCV RNA含量变化与病情的相关性. 方法:HCV抗体阳性样本80例,包括慢性肝炎(CH) 39例,肝硬化(LC)23例,肝癌(HCC)18例,献血员样本40例为正常对照.在HCV基因组5’非编码区(5’UTR)设计特异性引物和一对杂交探针,构建相应基因片段载体,体外转录RNA作为标准品,根据其建立的标准曲线对血清HCV RNA进行定量,同时用传统的套式RT-PCR进行定性分析. 结果:本法检测HCV RNA含量的线性范围为1012-104copies/L,批内和批间重复性测定的v分别为1.68-5.97%和6.40-10.58%.在HCV抗体阳性患者中, 肝硬化和肝癌患者的HCV RNA含量显著高于慢性肝炎患者(7.75±0.29,7.86±0.32 vs 4.67±0.41,P<0.05), 而且HCV RNA含量与ALT水平呈正相关(r=0.89, t=8.29,P<0.05). 结论:RFQ-RT-PCR检测HCV RNA含量具有较好的灵敏度和特异性,其含量与丙型肝炎患者的病情变化及严重程度有一定相关性.

SALL4在肝癌中的表达及其对预后的影响

目的 检测人类婆罗双树样基因4（SALL4）在肝癌中的表达情况,探讨SALL4表达与原发性肝细胞癌（HCC）患者预后的相关性。方法 应用免疫组织化学法检测60例石蜡HCC标本及其中32例癌旁组织标本SALL4蛋白的表达,分析其与HCC患者临床病理学资料及预后的关系;采用荧光定量RT-PCR、Western blot法,分别检测23例新鲜HCC及癌旁肝组织中SALL4mRNA和蛋白的相对含量。结果 HCC组织中SALL4蛋白的表达率（81.67%,49/60）显著高于癌旁组织（6.25%,2/32）,差异有统计学意义（χ~2=48.047,P〈0.01）;SALL4蛋白在HCC中的表达与甲胎蛋白水平有关（P〈0.05）;SALL4高表达和低表达组患者的平均生存时间分别为（26.20±2.37、34.05±1.26）个月,SALL4高表达组患者的1、3年生存率（75.9%、55.2%）显著低于SALL4低表达组1、3年生存率（95.0%、85.0%,χ~2=5.044,P〈0.05）。肝癌及癌旁组织的SALL4mRNA的相对量分别为14.80±8.62、0.17±0.13,两组比较差异有统计学意义（t=8.14,P〈0.01）。Western blot检测结果显示,SALL4蛋白在HCC中的相对量为0.354±0.103。癌旁组织中几乎不表达。结论 SALL4表达与肝癌患者预后密切相关,可作为肝癌患者判断预后的预测指标。

糖皮质激素受体在类风湿关节炎外周血单个核细胞中表达水平的研究

目的探讨类风湿关节炎(RA)患者外周血单个核细胞中糖皮质激素受体(GR)α、βmRNA的表达水平及其与RA发病机制、活动性的关系。方法从44例RA患者(活动期24例、缓解期20例)、20例健康对照人群外周血单个核细胞(PBMCs)中提取总RNA,并逆转录为cDNA。应用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-FQ-PCR)检测GRα和GRβmRNA的表达水平,并研究其与血沉(ESR)、C反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)的相关性。结果RA患者GRα和GRβmRNA的表达水平均明显高于健康对照人群(P﹤0.01);活动期RA患者GRβmRNA表达水平(-3.5442±0.8017)明显高于缓解期RA患者(1.2175±1.5969)(P﹤0.01);活动期RA患者GRαmRNA表达水平(4.2333±2.1775)与缓解期RA患者(4.2985±1.6109)比较无显著性差异(P﹥0.05);RA患者GRβ表达水平与CRP呈正相关(P=0.01),与ESR、RF均无关;RA患者GRα表达水平与CRP、ESR、RF均无关。结论GRα和GRβ的表达异常可能参与了RA的发病;GRβ表达水平与CRP呈明显正相关,提示其可能与RA疾病活动性相关。

沙门氏菌环丙沙星诱导株marR,soxR和acrR基因突变与多重耐药性的相关性研究(英文)

本文对11株动物源体外诱导的环丙沙星抗性沙门氏菌的m ar操纵子基因marO,marR,marA,marB,soxR,soxS和acrR基因(包括启动子区)的点突变进行检测,结果显示在沙门氏菌诱导株中marR,soxR和acrR基因检测到新突变,而marO,marA,marB和soxS基因未发现突变。应用实时荧光定量PCR对诱导株的marA和soxS基因及外排泵基因acrA,acrB和tolC的mRNA表达水平进行检测,结果表明这些基因的表达量均显著增加,且marA,soxS和acrAB-tolC的mRNA表达水平与沙门氏菌诱导株的多重耐药表型(M ar表型)相关,环丙沙星诱导株对其它氟喹诺酮类药物和结构不相关的抗生素均产生耐药。本研究结果表明沙门氏菌诱导株的调控基因突变和mar操纵子介导的acrAB-tolC的表达上调均贡献了沙门氏菌诱导株的氟喹诺酮抗性和Mar表型,且诱导株的marR,soxR和acrR基因突变与氟喹诺酮抗性和Mar表型具有相关性。

米蛾β-actin基因cDNA片段的克隆及表达量检测

为克隆米蛾[Corcyra cephalonica(Stainton)]β-actin基因cDNA片段,建立米蛾β-actin基因实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,并评估其在实时荧光定量研究中作为内参基因的可靠性,利用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆获得米蛾β-actin基因cDNA片段,采用SYBR GreenⅠ染料法建立qRT-PCR方法,检测在米蛾卵、幼虫、蛹和成虫4个虫态中β-actin基因的表达量。获得了长为822bp的米蛾β-actin基因片段(Gen Bank accession:KJ599569),编码273个氨基酸残基;荧光定量标准曲线的Ct值检测范围为13~28,扩增效率为90.1%,相关系数R^2=0.992,溶解曲线分析结果显示产物为特异的单峰,其Tm值为(84±0.5)℃,符合定量要求;实时荧光定量结果表明,β-actin基因在米蛾不同发育历期中的表达水平无显著性差异(p>0.05)。成功建立了米蛾β-actin基因qRT-PCR方法 ,β-actin基因可以作为米蛾基因表达定量研究中的可靠内参基因。研究结果为β-actin作内参基因进行米蛾功能基因表达差异研究奠定了分子基础。

实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测火器伤骨折愈合过程中骨形态发生蛋白的表达

目的应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测兔火器伤骨折愈合过程中骨形态发生蛋白(BMP)-2mRNA水平。方法建立外固定架固定一期治疗兔股骨火器伤骨折的动物模型和BMP-2 mRNA表达水平的SYBR G reenⅠ荧光定量RT-PCR方法,分别于术后第1、2、3、4周取断端组织,通过实时荧光定量RT-PCR检测标本标本中BMP-2 mRNA水平。结果在对照组,创伤后的兔骨组织BMP-2 mRNA表达水平在1周开始增高,在第2周达到高峰后下降,第4周即可恢复正常。而实验组,受枪伤的兔骨组织BMP-2 mRNA表达水平在第3周表达最高,与对照组相比,升高较慢,表达量也偏低(P<0.05)。结论BMP-2mRNA SYBR G reenⅠ荧光定量RT-PCR可以很好地反应枪击伤对兔骨组织BMP-2 mRNA表达水平的影响。枪击伤后的兔骨组织BMP-2 mRNA表达水平与对照组相比升高较慢,表达量也偏低。

扶正解毒颗粒对染镍大鼠肾组织及尿单核细胞趋化蛋白-1水平的影响

目的研究中药扶正解毒颗粒(FJG)对硫酸镍(NiSO4)暴露肾组织单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA表达的影响。方法 Wistar大鼠NiSO4(2.5 mg.kg-1.d-1)染毒造模,FJG灌胃处理,分别采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法和双缩脲比色法检测尿MCP-1和24 h尿蛋白含量;采用实时荧光定量RT-PCR检测肾组织MCP-1 mRNA表达的变化。结果 NiSO4组肾细胞MCP-1mRNA表达增强,尿MCP-1和24 h尿白蛋白含量增加;FJG组MCP-1 mRNA表达水平明显低于NiSO4组(RSD分别为4.3%,6.9%,7.4%),FJG组尿MCP-1和24 h尿白蛋白含量明显低于NiSO4组(P<0.05和P<0.01)。结论 MCP-1mRNA表达增强、尿MCP-1含量增加与镍性肾损伤存在一定关联,FJG干预镍肾毒性的作用可能与下调MCP-1mRNA表达及降低尿MCP-1水平有关。

HLA-GmRNA在肝癌患者外周血单个核细胞中的表达及意义

目的：了解肝细胞癌（HCC）患者外周血单个核细胞（PBMC）、人类白细胞抗原 G mRNA（HLA-G mRNA）的表达水平及其意义。方法收集44例 HCC患者、21例肝硬化患者和40例健康查体者的 PBMC，建立逆转录-实时荧光 PCR相对定量体系检测PBMC HLA-G mRNA相对表达量。结果 HCC组、肝硬化组和健康对照组的 HLA-G mRNA相对表达量分别为1.71±0.39，1.05±0.38和1.01±0.47，HCC组高于肝硬化组和对照组，差异有统计学意义（F＝33.657，P＜0.001）。HLA-G mRNA高表达的 HCC患者生存率低于 HLA-G mRNA低表达者，差异有统计学意义（χ2＝5.972，P＝0.015）。结论 PBMC HLA-G mRNA相对表达量与肝癌发生发展密切相关，检测 PBMC HLA-G mRNA有助于肝癌的诊断与研究。

血清中不同基因型丙型肝炎病毒RNA含量的测定

目的了解血清中不同基因型丙型肝炎病毒HCVRNA的含量。方法用实时荧光定量RTPCR和逆转录型特异性引物PCR同时检测21例费城酒精依赖丙肝患者的血清HCVRNA拷贝数并分析HCV基因型。结果21份血清标本中,有17份为HCVRNA阳性。这些阳性血清的HCVRNA含量波动范围在104.60～106.20拷贝/ml。检测到1a和1b两种HCV基因型,其中1a型7例,RNA平均滴度为105.28±0.75拷贝/ml,1b型(9例)RNA平均滴度为105.28±0.28拷贝/ml。结论定性和定量检测结果有极佳的一致性,酒精依赖丙肝基因型1a和1b血清中HCV含量无显著性差异。

Xpert®Xpress Flu/RSV Assay用于临床呼吸道感染病原学诊断的价值

目的评估体外诊断试剂Xpert®Xpress Flu/RSV Assay(Xpress Flu/RSV)对临床甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)和呼吸道合胞病毒(RSV)标本的检测性能。方法选择2018年1月11日至5月9日于南方医科大学珠江医院就诊的420例具有呼吸道感染症状的患者为研究对象,采集鼻咽拭子标本,分别采用Xpress Flu/RSV和普通聚合酶链反应(PCR)测序进行检测,结果不一致标本采用自建反转录实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)确认,以任意两种方法结果一致为标准,分析Xpress Flu/RSV的诊断性能。结果420例患者标本中Xpress Flu/RSV检出阳性213例(50.7%),灵敏度(FluA:100.0%;FluB:100.0%;RSV:100.0%)和特异度(FluA:100.0%;FluB:99.4%;RSV:99.7%)均较高;对其他呼吸道病原体(除FluA、FluB、RSV)感染标本检测结果均为阴性;95例患者标本Xpress Flu/RSV检测结果与自建RT-qPCR相比,一致性较高(Kappa值为0.949)。结论Xpress Flu/RSV检测性能较好,适用于病毒流行期的大规模筛查。

庚型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及其在男男同志人群中的应用

目的建立庚型肝炎病毒(GBV-C)的实时荧光定量PCR检测方法。方法根据GBV-C5’-端非编码区序列设计引物及其相应的TaqMan探针,构建质粒标准品,建立绝对定量检测方法,分别对99份HIV-1阳性和175份HIV-1阴性男男同性恋者标本进行检测。结果建立了绝对定量的参照质粒,标准曲线相关系数为0.99。99份HIV-1阳性标本中,34份检测结果为阳性;175份HIV-1阴性标本中,22份为阳性结果,检测结果线性范围良好,且均与定性巢式RT-PCR检测结果一致。结论 GBV-C实时荧光定量PCR检测方法具有快速、特异性强和稳定性好等优点,为进一步研究GBV-C与HIV-1共感染对HIV/AIDS患者疾病进程的影响提供了一定的技术支持和平台。

“荧光定量PCR溶解曲线法”监测HIV感染者TCR α链CDR3谱系漂移的研究

目的利用"荧光定量PCR溶解曲线分析技术"监测HIV感染者外周血T细胞TCRα链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。方法提取6例HIV感染者、4例健康者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中的总RNA,逆转录成cDNA,设计人32个TRAV基因家族上、下游引物,荧光定量PCR(FQ-PCR)扩增32个TRAV基因各家族CDR3谱系,溶解曲线法分析各家族CDR3谱系的单/寡/多克隆增生。结果健康者外周血T细胞TCRα链32个家族CDR3表达频率不一致,各家族PCR产物的"溶解曲线谱型图"显示多克隆增生的高斯分布,呈现溶点不同的CDR3多态性,6例HIV感染者的外周血TCRα链CDR3谱系的32个家族CDR3表达频率不一致,患者各家族PCR产物的"溶解曲线谱型图"显示多数家族为多克隆增生的高斯分布,但每个患者均出现数量不等的单克隆和寡克隆增生家族。结论荧光定量PCR溶解曲线法监测人TCRα链CDR3谱系漂移的方法稳定、简便,可以用来监测健康者和HIV感染者外周血T细胞TCRα链CDR3谱系漂移。

rRT-PCR与微量中和实验法用于脊灰病毒血清定型的比较

目的对实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(rRT-PCR)法和微量中和实验2种脊灰病毒的血清型鉴定方法进行评价。方法按世界卫生组织(WHO)《脊髓灰质炎实验室手册》第4版进行病毒分离,用rRT-PCR法和微量中和实验方法对分离到的L20B阳性分离物进行PV的血清型鉴定,用rRT-PCR法进行型内鉴定。结果 rRT-PCR法与微量中和实验对L20B阳性分离物进行脊灰病毒的血清型定型,2种方法检测脊灰病毒阳性率差异无统计学意义,检测NPEV阳性率差异也无统计学意义;rRT-PCR方法检测脊灰病毒的灵敏度为100%,特异度为100%;检测NPEV的灵敏度为63.16%,特异度为100%。结论作为WHO推荐使用的新的型内鉴定方法,rRT-PCR法对于脊灰病毒的血清型定型与常规微量中和实验一致率为100%,该方法方便快捷,可以缩短检测时限;对于NPEV的检测特异度较高,但灵敏度低于微量中和实验。

新型冠状病毒RNA标准物质

研制了一种新型冠状病毒(coronavirus, SARS-CoV-2)体外转录RNA标准物质,用于SARS-CoV-2病毒RNA检测的量值溯源.目标基因范围涵盖已公布的SARS-CoV-2病毒检测的3个主要靶标基因:核壳蛋白N基因全长(基因组坐标:28274-29533, GenBank:MT027064.1)、包膜蛋白E基因全长(基因组坐标:26245-26472, GenBank:MT027064.1)、开放阅读框1ab(ORF1ab)基因片段(基因组坐标:13321-15540, GenBank:MT027064.1).通过采用数字聚合酶链式反应(digital PCR, dPCR)方法进行多实验室联合定值,确定了该标准物质的量值为N、E和ORF1ab基因的拷贝数浓度.研究结果表明,该RNA标准物质量值可靠,均匀性良好,稳定性可满足运输要求.进一步地,通过在临床检验、多家不同原理的病毒检测试剂盒生产企业、方法开发实验室等试用,验证了RNA标准物质的普适性.这一RNA标准物质的研制为新型冠状病毒检测试剂盒的质量控制提供了计量学依据,为防控流行性疾病提供了便利.

武汉地区小牛和羊戊型肝炎病毒感染调查

目的调查湖北省武汉市小牛和羊戊型肝炎病毒(HEV)感染情况。方法从武汉地区分别采集小牛和羊血清样本397份和503份,用酶联免疫诊断试剂盒检测HEV抗原和抗体。对抗原或抗体阳性者用荧光RT-PCR检测HEV核酸,对阳性者采用套式RT-PCR进行扩增,并进行克隆和序列分析。选取核酸阳性样品接种猴子。结果羊血清中HEV抗体阳性率为21.87%(110份),抗原阳性率为12.33%(62份);抗原和抗体同时阳性者占2.78%(14份)小牛血清中HEV抗体阳性率为2.02%(8份),抗原阳性率为0%。仅1份羊血清为HEV核酸阳性,序列分析显示为HEV4型。结论武汉地区小牛HEV感染率较低,但羊的感染率相对较高。