甘薯褪绿矮化病毒西非株系RT-RPA-LFD检测方法的建立与应用

【目的】利用逆转录酶重组酶聚合酶扩增(reverse transcriptase recombinase polymerase amplification,RT-RPA)结合侧向流层析(lateral flow dipstick,LFD)试纸条技术,建立甘薯褪绿矮化病毒(sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)西非株系(west African strain,WA)的RT-RPA-LFD检测方法。【方法】根据SPCSV-WA外壳蛋白基因和热激蛋白基因的保守序列设计并筛选扩增效果好、特异性强的引物和探针。然后对引物和探针的浓度、扩增体系、温度、反应时间等条件进行优化,建立SPCSV-WA的RT-RPA-LFD检测方法。利用该方法对SPCSV-EA、甘薯羽状斑驳病毒(sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)、甘薯潜隐病毒(sweet potato latent virus,SPLV)、甘薯G病毒(sweet potato virus G,SPVG)等常见的甘薯病毒进行检测,验证方法的特异性;将感染SPCSV-WA甘薯叶片样品总RNA进行10倍梯度稀释,分别采用RT-PCR和RT-RPA-LFD进行检测,比较RT-PCR和RT-RPA-LFD方法的灵敏度;对采自田间的甘薯样品和试管苗样品进行RT-RPA、RT-RPA-LFD和RT-PCR检测,验证该方法的实用性。【结果】建立了SPCSV-WA的RT-RPA-LFD检测方法,最适引物为CSV357F/R,探针CSV-CP-Probe(47 bp),引物和探针工作浓度分别为0.2和0.06μmol·L^(-1),温度为42℃,时间5 min。该方法可对SPCSV-WA进行特异性检测,与甘薯上其他常见病毒无交叉反应。RT-RPA-LFD最低可检测到总RNA稀释至10^(-4)溶液,而RT-PCR最低检测到总RNA稀释至10^(-3)溶液,RT-RPA-LFD灵敏度是RT-PCR的10倍。田间采集的22份甘薯样品经RT-PCR、RT-RPA和RT-RPA-LFD检测,均检出11份阳性样品,3种方法检测结果一致。28份试管苗样品的检测结果表明,RT-PCR和RT-RPA-LFD检测结果一致,均检出5份阳性样品。【结论】建立了SPCSV-WA的RT-RPA-LFD检测方法,该方法具有快速、简便、特异、灵敏、可视的特点,既可用于甘薯脱毒试管苗样品的病毒检测,也适用于基层单位田间甘薯病毒样品的现场快速检测。

RT-RAA联合CRISPR/Cas12a快速检测新型冠状病毒方法的建立与评价

目的建立一种基于反转录酶-重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)联合簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas12a系统的快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的方法,并对其进行评价。方法根据NCBI数据库中SARS-CoV-2的核衣壳(N)基因设计RT-RAA引物和CRISPR来源RNA(crRNA),优化检测体系中乙酸镁(MgAc)用量、RT-RAA反应温度和时间以及LbCas12a反应温度。以100~106 copies/μL重组质粒和其他呼吸道病原体分别评估该方法灵敏度和特异性。采用RT-RAA-CRISPR/Cas12a法和RT-PCR法对70份临床标本进行平行检测,比较两种方法的符合率。结果优化后的RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测方法可在37℃条件下50 min内完成SARS-CoV-2检测。荧光法检测灵敏度为10 copies/μL,侧流层析法为1×102 copies/μL。该方法能特异检测SARS-CoV-2,与其他呼吸道病原体无交叉反应。RT-RAA-CRISPR/Cas12a法检测70份临床标本的结果与RT-PCR法完全一致,符合率为100%。结论建立的RT-RAA-CRISPR/Cas12a法检测SARS-CoV-2快速、经济、灵敏度高、特异性强,无需昂贵仪器设备,可由经验不足的人员操作,为临床快速诊断和现场大规模筛查SARS-CoV-2提供了新的思路和方法。

NoV GⅡ.2亚型RT-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的建立

近年来,一种新的诺如病毒GⅡ.2亚型(norovirus GⅡ.2,NoV GⅡ.2)通过牡蛎等生食海鲜感染人群,引发急性胃肠炎,并在全球广泛传播。为实现NoV感染的现场诊断和快速疫情响应,亟需建立快速便捷的NoV GⅡ.2亚型核酸检测方法。本研究通过设计引物、crRNA,经优化反应条件后,建立了NoV GⅡ.2亚型RTRPA-CRISPR/Cas12a检测方法。结果显示:利用引物NoV-GⅡ.2-F1B和NoV-GⅡ.2-R1对NoV GⅡ.2标准RNA进行RT-RPA扩增,结合crRNA1介导的CRISPR/Cas12a报告体系,能在40 min内完成NoV GⅡ.2核酸检测;该方法检测灵敏度为10 copies/μL,且与轮状病毒、腺病毒、星形病毒、人副肠孤病毒、博卡病毒和札如病毒无交叉反应;应用该方法和qRT-PCR法,分别对30份临床模拟样本进行检测,发现总符合率达96.67%。结果表明,本研究建立的NoV GⅡ.2亚型RT-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法无需依赖昂贵设备,具有灵敏度高、特异性强、操作便捷快速等特点,为NoV GⅡ.2感染的现场检测和防控提供了新方法。

双重荧光逆转录-聚合酶链式反应与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒

目的建立双重荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)快速有效地检测食品中食源性GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒基因组保守序列设计引探,经过一系列引探浓度筛选,建立了双重荧光RT-PCR和恒温荧光RT-RAA两种检测方法,分别从敏感性、特异性、稳定性、重复性等方面进行了比较研究;同时将这两种方法应用于实际临床样本检测中,并与GB4789.42—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》进行比对验证。结果建立的两种方法特异性良好,敏感性均可达10 copies/μL;双重荧光RT-PCR方法质粒梯度变异系数(coefficient of variation,CV)值在0.1%~1.5%区间,恒温荧光RT-RAA方法CV值在1.0%~10.0%区间,稳定性和重复性显示双重荧光RT-PCR优于恒温荧光RT-RAA检测方法;31份诺如病毒阳性食品核酸样本均能检出,且50份食品盲样检测结果与国标一致。结论本研究成功建立了双重荧光RT-PCR与恒温荧光RT-RAA快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒方法,两种方法各有优缺点,双重荧光RT-PCR稳定性和重复性好,恒温荧光RT-RAA检测时间短,仅20 min就能完成扩增,可根据不同需求选择一种或两种作为食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒的检测方法。

人偏肺病毒的逆转录重组酶介导等温扩增荧光检测方法的建立

目的建立一种基于逆转录重组酶介导的等温扩增(reverse transcription recombinase-aided isothermal amplification,RT-RAA)方法的人偏肺病毒快速分子诊断技术,并对其检测效果进行初步分析。方法从NCBI数据库中下载人偏病毒基因组序列,利用Mega软件比对分析基因组序列,确定高度保守序列作为分子检测靶标。以人偏肺病毒N蛋白基因保守序列作为靶序列,设计引物和荧光探针。并以宁波地区人偏肺病毒基因组RNA为模板,利用实时荧光定量PCR对荧光RT-RAA检测体系进行评价。以构建含有N蛋白基因序列的不同浓度重组质粒为模板进行RT-RAA荧光扩增,分析其检测灵敏性;利用建立的RT-RAA荧光法分析检测人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒和博卡病毒基因组,评价其检测特异性。结果成功建立了人偏肺病毒RT-RAA扩增荧光检测方法,可在30 min内完成偏肺病毒的特异性扩增检测。以重组质粒为检测模板,RT-RAA荧光检测法的最低检出限为102拷贝/μL重组质粒,且均在15 min内出现阳性特异性扩增。与实时荧光定量PCR检测一致性达98.6%,且与其他3种病毒无交叉反应特性。结论成功建立了一种基于RT-RAA扩增的人偏肺病毒荧光检测方法,该方法灵敏度高、特异性好,在人偏病毒快速现场检测中具有潜在应用价值。

基于RT-RAPID和CRISPR-Cas12a的诺如病毒GⅡ.6亚型核酸检测方法的建立

为建立一种特异性强、灵敏度高且简单方便的诺如病毒GⅡ.6核酸快速检测方法,下载诺如病毒GⅡ.6基因组序列,用Mega7.0对基因组进行比对分析获得高度保守序列;基于保守序列设计诺如病毒GⅡ.6的反转录重组酶和聚合酶等温检测(RT-RAPID)技术扩增引物、荧光探针、crRNA和报告分子;优化RT-RAPID的反应引物、反应温度和反应时间及Cas12a检测用的crRNA,并分析RT-RAPID-Cas12a方法的特异性和灵敏度。基于RT-RAPID荧光法和RT-RAPID-Cas12a荧光法的诺如病毒GⅡ.6亚型核酸快速检测方法能在1 h内完成检测并得出结果,灵敏度分别为10 copies/μL和0.5 copies/μL,且两个方法均与诺如病毒GⅡ.17型、鼻病毒、偏肺病毒和博卡病毒无交叉反应。2个检测方法与RT-qPCR阳性样本一致率均为90%,阴性样本一致率均为100%。论文建立的基于RT-RAPID和Cas12a的诺如病毒GⅡ.6核酸快速检测方法均可高效快速地检测出诺如病毒GⅡ.6,具有灵敏度高、特异性强、操作便捷且快速等特点。

双重荧光RT-ERA技术快速检测贝类食品中诺如病毒

目的:基于逆转录-酶促重组等温扩增(reverse transcription-enzymatic recombinase amplification,RTERA)技术,以MS2作为模式过程控制病毒,建立一种贝类食品中GI与GII型诺如病毒(norovirus,NoV)双重荧光RT-ERA快速检测方法。方法:分别将GI、GII NoV参考靶序列克隆到带有T7启动子的载体中,通过体外转录的方式获得高纯度NoV RNA参考样品。以设计的MS2噬菌体引物探针,与实验室前期筛选的GI、GII NoV引物探针进行双重荧光RT-ERA实验,并对反应体系和反应程序进行优化,分析方法的灵敏度。最后,采用建立的方法开展真实样本检测,以GB 4789.42-2016《食品微生物学检验诺如病毒检验》为参比方法进行检测结果对比,确定方法的准确性和可行性。结果:建立MS2与GI、MS2与GII两组双重荧光RT-ERA检测方法,最佳引物及探针体积分别为4.1μL与1.8μL,检测时间可缩短至10 min左右,且最低可检出102拷贝/μL的NoV核酸样品。应用所建立的方法对29份真实样品进行检测,检测结果与GB 4789.42-2016一致。结论:本研究建立的双重荧光RT-ERA检测方法可实现对MS2、GI和GII NoV的同时检测,且灵敏度高、准确性强,为今后NoV现场快速检测提供一定基础。

重组酶介导的等温扩增法检测H7N9禽流感病毒

目的建立H7N9禽流感病毒一步法逆转录重组酶介导的等温扩增的检测方法(RT-RAA)。方法根据H7N9禽流感病毒HA片段和NA片段的保守区序列分别设计引物、探针,建立RT-RAA方法,研究其特异性、敏感性,并与Realtime RT-PCR方法进行比较。结果成功建立了H7N9禽流感病毒RT-RAA检测方法,H7反应体系和N9反应体系的最低检出限分别为10copy/μL和100copy/μL,且与其他呼吸道病原无交叉反应。H7N9RT-RAA体系检测结果与Real-time RT-PCR一致性较高,Kappa检验u系数为0.933。结论建立的RT-RAA检测方法具有快速、特异及灵敏的特点,为H7N9禽流感病毒的快速检测提供了新的分子工具。

重组酶聚合酶扩增技术在人偏肺病毒快速诊断的方法建立与临床评价

目的:研究重组酶聚合酶扩增技术在人偏肺病毒(hMPV)快速诊断的方法建立与临床价值。方法:将2017年1月—2019年12月医院收治的急性呼吸道感染患儿200例纳入研究。分离获取hMPV阳性病毒株,检索Genbank数据库,检索hMPV株基因序列,采用生物信息学软件通过靶向特定区域,对hMPV的N基因和L基因2个位点进行检测,并设计引物及荧光探针,使用病毒株和阴性对照品对基于重组酶聚合酶扩增技术快速检测hMPV的方法进行性能评估。同时,对所有受试者均进行直接荧光免疫法检测。以逆转录—聚合酶反应(RT-PCR)检测结果为金标准,对比不同检测方式诊断hMPV的效能。此外,分析hMPV感染患者合并其他病毒感染情况。结果:以RT-PCR检测结果为金标准,重组酶聚合酶扩增技术诊断hMPV的灵敏度、特异度、准确度均明显高于直接荧光免疫法检测(均P<0.05)。hMPV感染患者合并其他病毒感染发生率为26.83%,其中主要涵盖冠状病毒9.76%、呼吸道合胞病毒7.32%、流感病毒4.88%等。结论:重组酶聚合酶扩增技术在hMPV快速诊断中的应用效果较佳,可获得较为理想的灵敏度、特异度以及准确度,有望成为替代传统PCR的有效检测方式,值得临床推广应用。

西尼罗河病毒RT-RPA检测方法的建立及初步应用

为建立快速特异的西尼罗河病毒(WNV)检测方法,本研究根据WNV基因保守区域基因序列,采用Primer Explorer Version 4设计特异性的重组酶聚合酶扩增(RPA)引物和探针。经过引物筛选和条件优化,建立了在39℃恒温条件下15 min内即可完成的实时荧光RT-RPA方法。本方法能特异性检测出WNV,且与蓝舌病毒(BTV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)核酸检测没有交叉反应。本方法灵敏性强,最小检出量为5.25×10^(2)拷贝/μL。采用创建的RT-RPA方法检测72份牛或猪的临床样品,结果与实时荧光定量PCR方法相符。说明本试验创建的WNV RT-RPA方法操作简便、灵敏度和特异性高,适用于WNV监测、基层实验室或出入境口岸对WNV的现场快速检测。

犬瘟热病毒实时荧光RT-RPA检测方法的建立及应用

为建立犬瘟热病毒(CDV)临床快速检测方法,针对CDV保守N基因依据重组酶聚合酶等温扩增(RPA)引物设计原理进行RPA引物探针设计,通过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验和临床样品检测,建立了CDV实时荧光RT-RPA检测方法。结果显示,反应体系中M-MLV反转录酶最适浓度为4 U/μL,所建CDV实时荧光RT-RPA检测方法特异性较好,敏感性最低可检测到5.68×102 copies/μL,高于国标RT-PCR(GB/T 27532-2011)检测方法。建立的CDV实时荧光RT-RPA检测方法具有较高的敏感性和特异性、操作简便、20 min内判定结果,可用于临床犬瘟热快速诊断,对犬瘟热的防控具有重要意义。

四重逆转录重组酶聚合酶等温扩增技术快速联检四种难鉴别蚊媒病毒的效果观察

目的建立针对登革病毒(DENV)、黄热病毒(YFV)、基孔肯雅病毒(CHIKV)、寨卡病毒(ZIKV)的四重逆转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)技术,用于同时快速检测上述4种病毒。方法通过正交设计建立检测4种蚊媒病毒(DENV、YFV、CHIKV、ZIKV)的四重RT-RPA反应体系。通过质粒标准品、体外转录RNA和临床血清验证单重RT-RPA和四重RT-RPA的检测灵敏度、特异度、重复性和临床应用符合率。结果单重RT-RPA对DENV、YFV、CHIKV、ZIKV质粒DNA的检出限分别为1×10^(2)、1×10^(2)、1×10^(2)、<1×10^(2) Copies/ml,对DENV、YFV、CHIKV和ZIKV体外合成RNA的检出限分别为1×10^(2)、1×10^(2)、1×10^(2)、1×10^(2) Copies/ml,四重RT-RPA对DENV、YFV、CHIKV和ZIKV质粒DNA的检出限分别为1×10^(2)、1×10^(2)、1×10^(2)、1×10^(2) Copies/ml,对体外合成RNA的检出限分别为5×10^(2)、5×10^(2)、5×10^(2)、5×10^(2) Copies/ml。本研究建立的单重及四重RT-RPA反应体系与其他常见病毒不存在交叉反应,RT-RPA法测定的阈值时间值(TT)的变异系数为1.76%~5.96%。四重RT-RPA法对不同病毒体外转录RNA检出率不同,DENV、YFV和CHIKV为100.00%,ZIKV为83.33%。单重RT-RPA、四重RT-RPA、RT-PCR对DENV临床样本的检出率无统计学差异(P>0.05)。结论本研究建立的针对DENV、YFV、CHIKV和ZIKV的单重RT-RPA和四重RT-RPA检测方法特异度好、灵敏度高、重复性好,对蚊媒传染病的早期诊断及鉴别诊断具有重要作用,同时也为其他新发再发传染病的快速诊断方法建立提供研究方向。

酶促重组等温扩增实时荧光法快速检测基孔肯雅病毒方法的建立

目的建立一种快速、准确、高灵敏度检测基孔肯雅病毒(chikungunya virus,CHIKV)的逆转录-酶促重组等温扩增(reverse transcription enzymatic recombinase amplification,RT-ERA)的基因检测技术方法.方法以CHIKV非结构蛋白1(non-structural protein 1,NSP1)基因的保守序列为靶标,根据RT-ERA反应原理设计、合成荧光探针及对应引物,以pUC18为载体构建靶标质粒并在体外转录后作为阳性对照品,将阳性对照品倍比稀释后筛选出扩增效率最高的探针引物组合.利用筛选的探针引物组合,对不同拷贝数的CHIKV进行荧光RT-ERA法扩增,评价该方法的最低检出限;再分别以森林脑炎病毒、登革热病毒、寨卡病毒、乙型脑炎病毒、新布尼亚病毒的RNA为模板进行荧光RT-ERA法扩增,评价该方法的特异性.结果在40℃恒温条件下,利用荧光RT-ERA法10 min内可以完成CHIKV核酸扩增,该方法最低检出限可达10拷贝/μL,且当CHIKV核酸扩增为阳性时,其他病毒检测结果为阴性.结论成功建立一种可用于检测CHIKV NSP1基因的荧光RT-ERA法,该方法操作简便、检测限低且特异性好.

基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒快速检测方法的建立

[目的]本研究将CRISPR/Cas12a系统与反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)结合,拟建立一种基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)快速检测方法。[方法]分析不同基因型PRRSV全基因组序列,在3′-UTR端保守区设计重组酶介导等温核酸扩增技术(RAA)引物、crRNA及DNA报告底物分子,筛选RT-RAA最佳引物对。表达纯化AsCas12a蛋白,并以质粒为标准品,经RT-RAA扩增后,将产物加入CRISPR/Cas12a系统,建立PRRSV的CRISPR/Cas12a-RT-RAA检测方法,分别以PRRSV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)核酸为模板验证建立方法的特异性,以不同浓度的pMD18T-PRRSV为模板验证建立方法的敏感性。以5.62×10^(6)、5.62×10^(3)、5.62拷贝数/μL的质粒为模板进行重复性试验,最后进行临床效果评价,将所建立的方法与实时荧光定量逆转录PCR方法进行比较。[结果]本研究成功表达并纯化获得具有良好剪切活性的AsCas12a蛋白,蛋白分子质量大小为196 ku;所建立的CRISPR/Cas12a-RT-RAA方法的检测下限可达5.62拷贝/μL;该方法具有良好的特异性,可特异性检测出PRRSV,不能检出其他猪病病毒PCV2、PEDV、CSFV和PRV,并具有良好的重复性。应用该方法对121份猪组织样品进行检测,与实时荧光定量逆转录PCR的阳性符合率为93.75%,阴性符合率为99.05%,总符合率为99.17%。[结论]本研究成功建立基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的PRRSV快速检测方法,该方法特异性强、灵敏性高、重复性好且不依赖复杂设备,可在现场和基层实验室使用。

菊花B病毒和番茄不孕病毒RT-RPA双重荧光实时检测体系的构建与性能评价

菊花B病毒(Chrysanthemum virus B, CVB)和番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus, TAV)是危害菊花的2种主要优势病毒。为构建一种同步检测CVB和TAV逆转录重组酶聚合酶恒温核酸扩增(Reverse transcriptionrecombinase polymerase amplification, RT-RPA)双重荧光实时检测方法,本研究以CVB和TAV编码外壳蛋白(coat protein, CP)基因保守区域作为靶标设计RIA引物和探针,CVB和TAV探针的5’端分别标记FAM和VIC荧光素,通过对商业化的RT-RPA试剂筛选,引物探针的组合筛选,扩增体系的优化和扩增条件的摸索试验,构建了一种可同时用于CVB和TAV检测的RT-RPA双重荧光实时检测方法。并对该体系进行优化,优化后RT-RPA双重荧光扩增体系中CVB和TAV的最优引物浓度为400 nmol/L,最优探针浓度分别为100 nmol/L和120 nmol/L;最适反应温度为39℃,最适反应时间为15 min。在此扩增体系和条件下,对CVB和TAV的检测敏感性均为1拷贝/μL;对烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、菊花矮化类病毒和褪绿斑驳类病毒核酸检测结果为阴性,对菊花B病毒、番茄不孕病毒核酸检测结果为阳性;对1.0×10^(4)拷贝/μL和10拷贝/μL的高、低两种浓度的质粒平行检测10次,检测荧光出现阳性扩增拐点所需的时间T变异系数均小于5%,重复性好。采用RTRPA和RT-qPCR方法同步对实验室留存的有症状的100株菊花进行核酸提取并检测,检出6例CVB病毒株和4例TAV病毒株,总符合率100%。因此,本研究建立了一种能同时检测CVB和TAV的快速、灵敏的RT-RPA双重荧光实时检测方法。

基于CRISPR/Cas12a系统的人副流感病毒1-4型核酸等温检测方法的建立

目的建立一种基于反转录重组酶介导的等温扩增(reverse transcription recombinase-aid amplification,RT-RAA)联合CRISPR/Cas12a反应的人副流感病毒(human parainfluenza virus,HPIV)核酸检测方法。方法根据HPIV核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N)基因保守区序列,设计RT-RAA所需型特异性引物及crRNA(CRISPR RNA,crRNA),应用Cas12a切割荧光标记探针产生的荧光强度筛选高敏感性HPIV1-4型特异性crRNA并优化crRNA、Cas12a和探针浓度。利用体外转录RNA及临床样本,评价RT-RAA联合CRISPR/Cas12a检测方法的检测下限及特异性。结果从设计的crRNA中筛选出高敏感性的HPIV1-4型特异性crRNA,并建立基于荧光强度测量的RT-RAA联合CRISPR/Cas12a的HPIV核酸检测方法,该方法对各型HPIV的检测下限均可达到10拷贝/反应。采用该方法检测8种其他呼吸道病毒感染的临床样本,均未显示有交叉反应。结论建立的HPIV 1-4型荧光法CRISPR核酸检测方法快速、特异,且可无需专业核酸检测设备。

塞内卡谷病毒荧光RT-RPA快速检测方法的建立

本研究利用重组酶聚合酶扩增（RPA）技术建立快速检测塞内卡谷病毒（SVV）的实时荧光RT-RPA方法。试验结果表明,该方法特异性强,能准确检测SVV核酸,与水泡性口炎病毒（VSV-IND和VSV-NJ）、猪水泡病病毒（SVDV）、口蹄疫病毒（FMDV）、猪瘟病毒（CSFV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）等灭活抗原核酸无交叉反应;灵敏度高,本试验中最低可检测SVV核酸浓度为1.35×10^（-3）g/mL;简便快速,反应时间小于20 min;重复性好。利用所建立方法对116份临床样品进行检测,结果与实时荧光RT-PCR一致。本研究为SVV防控提供了一种快速检测的新方法,可用于基层实验室对SVV的快速检测。

口蹄疫病毒real-time RT-RPA检测方法的建立与应用

为了建立口蹄疫病毒(FMDV)的快速检测方法,试验以FMDV 3D基因作为靶基因设计引物和探针,建立了一种新的实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增(real-time RT-RPA)检测方法,该方法在40℃恒温条件下20 min内完成检测,并评估了该方法的特异性、敏感性和重复性。结果表明:该检测方法能特异性检测FMDV,敏感性为500拷贝/反应,而且具有很好的重复性。利用该方法对采集的临床样品进行检测,检测结果与RT-q PCR检测结果具有100%的符合率。说明real-time RT-RPA方法具有简单、快速、特异性强的优点,是一种潜在的FMDV快速检测方法。

甲型流感病毒的逆转录重组酶介导核酸扩增快速检测方法研究

目的利用逆转录重组酶介导核酸扩增技术(RT-RAA)建立检测甲型流感病毒的快速方法。方法通过使用逆转录酶,将甲流病毒RNA逆转录为cDNA,根据NCBI基因库中甲型流感病毒保守序列设计引物及探针,用cDNA作模板,进行RT-RAA检测甲型流感病毒;构建携带甲型流感病毒的质粒,检测已知样本,分析该方法的灵敏度和特异性。结果采用甲型流感病毒通用型引物和探针,能有效扩增出相应病毒的核酸,而对其他非甲流病毒无交叉反应;RT-RAA反应过程均在39℃恒温条件下完成,用时30min即可得到扩增结果,反应体系中最低扩增拷贝数为100copies。结论建立的RT-RAA检测甲型流感病毒方法灵敏度和特异性高,反应快速、操作简单,适用于甲型流感病毒通用型的快速检测。

塔希纳病毒的重组酶介导扩增快速检测方法

目的采用反转录重组酶介导核酸扩增(RT-RAA)方法建立塔希纳病毒(TAHV)检测方法。方法在TAHV S节段保守区设计引物和探针。用构建含检测目的基因片段的质粒和病毒细胞培养物对TAHV的RT-RAA检测方法的灵敏性进行评价,通过检测黄病毒属、甲病毒属、正布尼亚病毒属和东南亚十二节段病毒属共7种病毒验证方法的特异性。并选用2018年采集自宁夏回族自治区的30批次蚊虫样本来评价该检测方法。结果该方法对构建的质粒标准品的检测下线为100拷贝/反应,病毒培养物最低检出限为10空斑形成单位/反应,与其他7种虫媒病毒无交叉反应。在检测蚊虫样本时,该方法与实时定量PCR方法检测结果的一致性为100%。结论建立了快速、特异以及灵敏的TAHV的RT-RAA检测方法,并适用于标本中TAHV核酸的现场检测。