甘薯褪绿矮化病毒西非株系RT-RPA-LFD检测方法的建立与应用

【目的】利用逆转录酶重组酶聚合酶扩增(reverse transcriptase recombinase polymerase amplification,RT-RPA)结合侧向流层析(lateral flow dipstick,LFD)试纸条技术,建立甘薯褪绿矮化病毒(sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)西非株系(west African strain,WA)的RT-RPA-LFD检测方法。【方法】根据SPCSV-WA外壳蛋白基因和热激蛋白基因的保守序列设计并筛选扩增效果好、特异性强的引物和探针。然后对引物和探针的浓度、扩增体系、温度、反应时间等条件进行优化,建立SPCSV-WA的RT-RPA-LFD检测方法。利用该方法对SPCSV-EA、甘薯羽状斑驳病毒(sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)、甘薯潜隐病毒(sweet potato latent virus,SPLV)、甘薯G病毒(sweet potato virus G,SPVG)等常见的甘薯病毒进行检测,验证方法的特异性;将感染SPCSV-WA甘薯叶片样品总RNA进行10倍梯度稀释,分别采用RT-PCR和RT-RPA-LFD进行检测,比较RT-PCR和RT-RPA-LFD方法的灵敏度;对采自田间的甘薯样品和试管苗样品进行RT-RPA、RT-RPA-LFD和RT-PCR检测,验证该方法的实用性。【结果】建立了SPCSV-WA的RT-RPA-LFD检测方法,最适引物为CSV357F/R,探针CSV-CP-Probe(47 bp),引物和探针工作浓度分别为0.2和0.06μmol·L^(-1),温度为42℃,时间5 min。该方法可对SPCSV-WA进行特异性检测,与甘薯上其他常见病毒无交叉反应。RT-RPA-LFD最低可检测到总RNA稀释至10^(-4)溶液,而RT-PCR最低检测到总RNA稀释至10^(-3)溶液,RT-RPA-LFD灵敏度是RT-PCR的10倍。田间采集的22份甘薯样品经RT-PCR、RT-RPA和RT-RPA-LFD检测,均检出11份阳性样品,3种方法检测结果一致。28份试管苗样品的检测结果表明,RT-PCR和RT-RPA-LFD检测结果一致,均检出5份阳性样品。【结论】建立了SPCSV-WA的RT-RPA-LFD检测方法,该方法具有快速、简便、特异、灵敏、可视的特点,既可用于甘薯脱毒试管苗样品的病毒检测,也适用于基层单位田间甘薯病毒样品的现场快速检测。

NoV GⅡ.2亚型RT-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的建立

近年来,一种新的诺如病毒GⅡ.2亚型(norovirus GⅡ.2,NoV GⅡ.2)通过牡蛎等生食海鲜感染人群,引发急性胃肠炎,并在全球广泛传播。为实现NoV感染的现场诊断和快速疫情响应,亟需建立快速便捷的NoV GⅡ.2亚型核酸检测方法。本研究通过设计引物、crRNA,经优化反应条件后,建立了NoV GⅡ.2亚型RTRPA-CRISPR/Cas12a检测方法。结果显示:利用引物NoV-GⅡ.2-F1B和NoV-GⅡ.2-R1对NoV GⅡ.2标准RNA进行RT-RPA扩增,结合crRNA1介导的CRISPR/Cas12a报告体系,能在40 min内完成NoV GⅡ.2核酸检测;该方法检测灵敏度为10 copies/μL,且与轮状病毒、腺病毒、星形病毒、人副肠孤病毒、博卡病毒和札如病毒无交叉反应;应用该方法和qRT-PCR法,分别对30份临床模拟样本进行检测,发现总符合率达96.67%。结果表明,本研究建立的NoV GⅡ.2亚型RT-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法无需依赖昂贵设备,具有灵敏度高、特异性强、操作便捷快速等特点,为NoV GⅡ.2感染的现场检测和防控提供了新方法。

基于直扩RT-PCR技术的寨卡病毒快速检测方法的建立

目的建立基于直扩实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术的寨卡病毒快速检测方法。方法采用特殊功能的DNA聚合酶,以及优选PCR增强剂,以此建立直扩RT-PCR技术的寨卡病毒快速检测5种样本(全血、血清、唾液、咽拭子和尿)的方法。结果5种样本检测限分别为血清103 PFU/mL,尿、咽拭子和唾液102 PFU/mL,全血104 PFU/mL,标准曲线的拟合优度的可决系数均在0.98以上,扩增效率均在90%~110%;寨卡病毒核酸成功扩增,非寨卡病毒核酸均未能扩增;尿、全血和唾液样本的重复性实验中106 PFU/mL和102 PFU/mL两个浓度的6个重复Ct值的变异系数均<5%。该研究建立的直扩RT-PCR技术的寨卡病毒检测方法与常规RT-PCR技术的检测结果一致,8个寨卡病毒样本,均只检测出2个血清样本,其余62个非寨卡病毒样本及12个阴性样本均未得到扩增。结论成功建立基于直扩RT-PCR技术的寨卡病毒快速检测方法,该方法简便快捷且灵敏度高、特异度强。

双重荧光逆转录-聚合酶链式反应与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒

目的建立双重荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)快速有效地检测食品中食源性GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒基因组保守序列设计引探,经过一系列引探浓度筛选,建立了双重荧光RT-PCR和恒温荧光RT-RAA两种检测方法,分别从敏感性、特异性、稳定性、重复性等方面进行了比较研究;同时将这两种方法应用于实际临床样本检测中,并与GB4789.42—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》进行比对验证。结果建立的两种方法特异性良好,敏感性均可达10 copies/μL;双重荧光RT-PCR方法质粒梯度变异系数(coefficient of variation,CV)值在0.1%~1.5%区间,恒温荧光RT-RAA方法CV值在1.0%~10.0%区间,稳定性和重复性显示双重荧光RT-PCR优于恒温荧光RT-RAA检测方法;31份诺如病毒阳性食品核酸样本均能检出,且50份食品盲样检测结果与国标一致。结论本研究成功建立了双重荧光RT-PCR与恒温荧光RT-RAA快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒方法,两种方法各有优缺点,双重荧光RT-PCR稳定性和重复性好,恒温荧光RT-RAA检测时间短,仅20 min就能完成扩增,可根据不同需求选择一种或两种作为食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒的检测方法。

猪传染性胃肠炎病毒分子检测方法研究进展

猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒引起的一种高度接触性肠道传染病,给全球养猪业造成了重大损失。精准检测传染性胃肠炎病毒对科学防控猪传染性胃肠炎具有重要的理论及现实意义。鉴于此,作者综述了近10年来猪传染性胃肠炎病毒分子检测方法的研究进展,主要包括免疫学检测技术(酶联免疫吸附试验、免疫荧光方法、免疫酶组织化学法、免疫传感器系统)、基于逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的检测技术(常规RT-PCR、巢式RT-PCR、多重RT-PCR、荧光RT-PCR、多重荧光RT-PCR、纳米PCR)、核酸等温扩增技术(环介导等温扩增、重组酶聚合酶扩增、重组酶介导核酸等温扩增、恒温隔绝式RT-PCR)、芯片检测技术(液相芯片检测方法、多重液相芯片方法、cDNA芯片)等。此外,对这些方法的优缺点和传染性胃肠炎病毒分子检测方法未来发展方向进行了展望,以期为猪传染性胃肠炎的早期诊断和科学防控提供参考依据。

马铃薯卷叶病毒RT-LAMP检测方法的建立

为建立一种快速准确检测马铃薯卷叶病毒(potato leafroll virus,PLRV)的方法,本研究以PLRV CP(coat protein,CP)基因ORF3保守序列为靶标,建立了PLRV反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测体系,并对建立的RT-LAMP检测体系的特异性、灵敏度、实际应用效果进行评估。结果表明,建立的PLRV RT-LAMP检测方法,在62℃恒温下扩增50 min,扩增产物中加入双链嵌合荧光染色(SYBR GreenⅠ),阳性样品颜色变为绿色,阴性样品颜色仍为褐色,可直接目测判断待检测样品是否感染PLRV。该方法只特异性检测PLRV,不与马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯A病毒(PVA)和马铃薯M病毒(PVM)等其他5种马铃薯主要病毒发生交叉反应。此外,建立的PLRV RT-LAMP检测方法的灵敏度较反转录PCR(RT-PCR)方法高100倍。田间样品检测验证,该方法与标准RT-PCR方法符合率达100%。本研究建立的以SYBR GreenΙ为颜色指示的PLRV可视化检测RT-LAMP方法,特异、灵敏、便捷,成本低,可满足科研、基层单位对该病毒快速诊断和检测的需要。

兜兰DEFICIENS(DEF)-和GLOBOSA(GLO)-like基因的克隆及表达分析

以‘同色兜兰’品种为材料,采用RT-PCR和RACE技术获得了DEFICIENS(DEF)-和GLOBOSA(GLO)-like基因的cDNA全长,命名为PcDEF和PcGLO,并用半定量RT-PCR和实时PCR研究了PcDEF和PcGLO在花芽发育过程和不同组织部位的表达特性。结果表明,PcDEF和PcGLO的全长cDNA分别为1 039bp和934bp,分别编码224和210个氨基酸;蛋白比对表明,PcDEF和PcGLO蛋白都具有典型MADS-box蛋白的MADS和K结构域;蛋白同源性分析显示,PcDEF和PcGLO与已登录的其它兰科植物的DEF/AP3和GLO/PI蛋白的相似性分别在75%～96%和87%～98%;系统进化树分析表明,PcDEF和PcGLO分别属于B类MADS-box蛋白家族的AP3和PI亚家族。表达分析显示,PcDEF和PcGLO在花芽发育中均有表达,PcDEF在成熟花、唇瓣和花瓣中的表达量高,在蕊柱、萼片、苞叶和根中次之,在花茎和叶中较低,在子房中几乎不表达;PcGLO在各组织中均有不同丰度的表达。

口蹄疫病毒real-time RT-RPA检测方法的建立与应用

为了建立口蹄疫病毒(FMDV)的快速检测方法,试验以FMDV 3D基因作为靶基因设计引物和探针,建立了一种新的实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增(real-time RT-RPA)检测方法,该方法在40℃恒温条件下20 min内完成检测,并评估了该方法的特异性、敏感性和重复性。结果表明:该检测方法能特异性检测FMDV,敏感性为500拷贝/反应,而且具有很好的重复性。利用该方法对采集的临床样品进行检测,检测结果与RT-q PCR检测结果具有100%的符合率。说明real-time RT-RPA方法具有简单、快速、特异性强的优点,是一种潜在的FMDV快速检测方法。

四川南充地区1056例地中海贫血初筛阳性样本的基因诊断结果分析

目的:了解四川南充地区人群α、β-地中海贫血的基因类型及分布特征。方法:选取南充市中心医院2015年7月至2017年7月就诊的MCV、MCH异常(MCV<80 fl和或MCH<27 pg),且已排除缺铁性贫血和其他贫血性疾病的疑似地中海贫血患者,采集EDTA抗凝静脉血3 m L,采用国际先进的多聚酶链扩增(GAP-PCR)技术和DNA芯片反向斑点杂交检测技术进行α、β-地中海贫血基因检测,包括α-地贫的3种缺失型(--SEA/αα、-α4.2/αα、-α3.7/αα、)、3种突变型(-ααCS/αα、-ααQS/αα、-ααWS/αα)及β-地贫的17种突变位点。结果:1 056例样本中共检出α、β-地贫330例,检出率为31.3%。其中,α-地贫168例(15.9%),β-地贫161例(15.3%),αβ复合突变1例(0.1%)。在330例确诊地贫样本中,α-地贫168例,构成比50.9%,有6种亚型:--SEA/αα、-α4.2/αα、-α3.7/αα、-ααCS/αα、-ααQS/αα、--SEA/-α3.7,以--SEA/αα(72.6%)、-α3.7/αα(17.9%)为主,占α-地贫的90.5%;β-地贫161例,构成比8.8%,有6种类型:CD17、CD41-42、-28、-29、IVS-II 654、CD41-42/-29,其中最常见的3种突变类型为:CD17(50.3%)、CD41-42(31.1%)及IVS-II 654(14.3%),占β-地贫的95.7%;α复合β-地贫1例(0.3%),基因型为-α3.7/αα复合βIVS-II-654M。1 056例受检者中,男性369例,检出地贫90例(24.4%),女性687例,检出地贫240例(34.9%),女性地贫基因检出率明显高于男性,差异具有统计学意义(χ2=12.423,P=0.001)。结论:四川南充地区是地中海贫血高发地区之一,α-地贫最常见的基因型为--SEA/aa,β-地贫以17M突变型最常见。

小鼠肝炎病毒逆转录环介导等温扩增检测技术的建立

目的建立小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测技术并进行初步应用。方法针对MHV核衣壳蛋白基因序列设计6条特异性引物,以MHV基因组RNA为模板,进行RT-LAMP反应。扩增产物通过浊度、SYBR green I荧光染料显色及电泳三种方法观察结果。同时,用限制性内切酶AluI对扩增产物进行酶切鉴定。进行RT-LAMP特异性和敏感性试验。最后用建立的RT-LAMP方法检测55份小鼠临床样本。结果RT-LAMP技术简单快速,等温条件下(65℃)一个小时内即可完成反应。酶切结果证明RT-LAMP产物正确。该技术具有很高的特异性和敏感性,可检测到的MHV RNA最低浓度为0.1 pg/μL,比逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)灵敏10倍。临床样本检测结果显示,与RT-PCR比较RT-LAMP方法的敏感性和特异性分别为100%和83.3%。结论RT-LAMP技术是一种快速、简便诊断方法,该方法检测特异性强、敏感性高,可以成为快速准确检测MHV的有效手段。

银染mRNA差异显示方法的建立

目的 建立银染 m RNA差异显示方法 ,为差异表达基因片断的分离克隆奠定基础。 方法 采用随机引物和锚定引物各 1条 ,建立差异显示反转录聚合酶链式反应 (DDRT- PCR)和银染方法 ,对 DDRT- PCR过程中各实验影响因素进行优化 ,割取差异条带进行二次扩增。 结果 当总 RNA用量为 0 .2μg,引物浓度为 0 .6～ 1.0μm ol/ L ,d NTP浓度为 2 0 0μmol/ L ,Mg Cl2 浓度为 1.6～ 2 .0 mm ol/ L时 ,同时起始 5个循环的退火温度为 5 0℃ ,扩增效率最佳 ,特异性好 ,背景干净。 结论 DDRT- PCR方法简便、快捷、灵敏、高效 ,可用于分离差异表达基因。

克隆与序列分析中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)HSP70基因全长ORF的RACE

采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)的Hsp70基因并进行序列分析.以中华绒螯蟹卵组织cDNA为模板,克隆测序后拼接得到一条长2 429 bp的cDNA序列,序列分析表明其覆盖了完整编码区,编码649个氨基酸.经antheprot分析发现2个Hsp70基因的签名序列:IFDLGGGTFDVSIL,IVLVGGSTRIPKIQK;Dnak特征基序DLGTT-S-V;非细胞器基序:RARFEEL;核定位信号标签:KKDPSESKRALRRL;胞质Hsp70特征基序GPTIEEVD.经BLASTn和BLASTx软件分析,该编码区核苷酸序列与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、斑节对虾(Penaeus monodon)的相似性分别为85.30%和84.89%.根据核苷酸序列所推导出的Hsp70氨基酸序列,其与斑节对虾、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)的相似性分别为93.23%和93.40%.本研究克隆了中华绒螯蟹的Hsp70基因,为进一步深入研究锯缘青蟹的抗逆机理及其遗传改良奠定了基础.

L-甲状腺素诱导心肌肥厚模型下电压依赖性钾通道信使核糖核酸的表达

目的 :探讨心肌肥厚易致心律失常的机制。 方法 :SD大鼠实验组 9只 ,对照组 7只 ,用 L -甲状腺素诱导法制备大鼠心肌肥厚模型 ,用逆转录多聚酶链反应方法(RT- PCR)半定量分析肥厚心肌内电压依赖性 K+ 通道信使核糖核酸 (m RNA)水平。 结果 :实验组与对照组相比 ,实验组即肥厚心肌内电压依赖性 K+ 通道 m RNA的表达水平显著下降 (P<0 .0 5 )。 结论 :电压依赖性 K+ 通道是心肌电活动的主要离子通道 ,心肌肥厚时电压依赖性 K+ 通道基因表达水平下降 ,可能会导致动作电位复极化时间延长 。

上皮性卵巢肿瘤端粒酶活性及其各亚单位基因表达的研究

目的:探讨端粒酶及其亚单位(hTERT、TP1、hTR)在卵巢癌发生和发展中的作用,研究端粒酶活性与各亚单位表达的相关性。方法:应用逆转录-聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)技术检测66例卵巢上皮性肿瘤及10例正常卵巢组织端粒酶不同亚单位基因的表达情况,应用端粒重复序列扩增技术(telomeraserepeatamplificationprotocol,TRAP)检测其中45例卵巢上皮性肿瘤及9例正常卵巢组织端粒酶活性。结果:1)恶性、交界性卵巢肿瘤组织中端粒酶阳性检出率分别为83.33%(25/30)、71.43%(5/7),两组间无显著性差异(P>0.05),而良性上皮性卵巢肿瘤及正常卵巢上皮中未检测到端粒酶活性,与前两组之间均有显著差异(P<0.001);2)RT-PCR定性检测发现hTR和TP1mRNA在检测的各组组织中均有表达,而hTERTmRNA主要在上皮性卵巢癌和交界性卵巢肿瘤中表达,二者间hTERTmRNA表达的差别无统计学意义(P>0.05),而与良性及正常组织hTERT表达有显著差异(P<0.001);3)端粒酶活性与hTERT亚单位表达明显相关(P<0.001),而与hTR和TP1亚单位表达无明显相关性(P>0.05)。结论:端粒酶与卵巢癌发生发展过程密切相关;hTERT表达与端粒酶活性密切相关,并可能参与端粒酶的活性调节,hTERT的表达有望成为上皮性卵巢癌的诊断指标。

虹鳟Ndufb2基因全长cDNA序列的克隆与分析

从虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)的脑组织中提取RNA,经逆转录-聚合酶链反应及cDNA末端快速扩增技术克隆出Ndufb2基因全长cDNA序列(GenBank登录号:FJ534641),并对其序列进行分析.扩增结果表明:Ndufb2基因的cDNA序列全长899bp,其中5′端非翻译区长152bp,3′端非翻译区长441bp,开放阅读框长306bp,编码101个氨基酸;其N端前50个氨基酸为线粒体靶序列.将翻译的虹鳟Ndufb2蛋白序列与大西洋鲑(Salmo salar)的Ndufb2蛋白序列比对发现,其同源性高达98%,且虹鳟Ndufb2蛋白序列与已报道的哺乳动物的Ndufb2蛋白序列同源性均在55%以上.表明Ndufb2基因在进化过程中是高度保守的,推测其在线粒体呼吸链组成中发挥着重要作用.

重组酶聚合酶扩增技术在人偏肺病毒快速诊断的方法建立与临床评价

目的:研究重组酶聚合酶扩增技术在人偏肺病毒(hMPV)快速诊断的方法建立与临床价值。方法:将2017年1月—2019年12月医院收治的急性呼吸道感染患儿200例纳入研究。分离获取hMPV阳性病毒株,检索Genbank数据库,检索hMPV株基因序列,采用生物信息学软件通过靶向特定区域,对hMPV的N基因和L基因2个位点进行检测,并设计引物及荧光探针,使用病毒株和阴性对照品对基于重组酶聚合酶扩增技术快速检测hMPV的方法进行性能评估。同时,对所有受试者均进行直接荧光免疫法检测。以逆转录—聚合酶反应(RT-PCR)检测结果为金标准,对比不同检测方式诊断hMPV的效能。此外,分析hMPV感染患者合并其他病毒感染情况。结果:以RT-PCR检测结果为金标准,重组酶聚合酶扩增技术诊断hMPV的灵敏度、特异度、准确度均明显高于直接荧光免疫法检测(均P<0.05)。hMPV感染患者合并其他病毒感染发生率为26.83%,其中主要涵盖冠状病毒9.76%、呼吸道合胞病毒7.32%、流感病毒4.88%等。结论:重组酶聚合酶扩增技术在hMPV快速诊断中的应用效果较佳,可获得较为理想的灵敏度、特异度以及准确度,有望成为替代传统PCR的有效检测方式,值得临床推广应用。

SARS病毒基因的PCR扩增及序列测定

目的 利用 RT- PCR技术检测 SARS疑似或临床确诊病人咽拭子、血清及白细胞中的 SARS病毒 ,并分析了扩增产物内一个可能的突变位点。 方法 采用 Trizol试剂或病毒 RNA提取试剂盒 ,抽提 SARS疑似患者咽拭子、血清及外周血白细胞中的 RNA ,进行 RT- PCR和 nest PCR反应 ,检测 SARS病毒 RNA ,并对扩增产物进行 DNA测序。 结果 14例SARS疑似患者中 2例咽拭子 RT- PCR结果阳性 ,约占 14 % ;5例临床确诊病人中 2例咽拭子 nest PCR结果阳性 ,约占 4 0 % ;6例临床确诊 SARS病人中 1例血清 nest PCR结果阳性 ,占 17% ,其他 5例疑似患者结果阴性 ;在 2 2份疑似患者外周血白细胞中未检测到 SARS病毒 ;扩增产物 DNA序列与美国和加拿大在 Gen Bank中报道的序列一致。 结论 RT- PCR方法是一种快速有效的 SARS病毒检测手段 ,为临床诊断及发病机制研究提供了依据 ;扩增片段内未发现突变。

p73基因在结肠癌组织中的表达及其临床意义

目的 :研究p73基因在结肠癌组织中的表达及其与结肠癌发生、发展的关系。方法 :采用逆转录聚合酶链反应和催化信号放大法检测 48例结肠癌及癌旁组织中p73基因和P73蛋白的表达情况 ,分析其表达与临床分期及病理分级的关系。结果 :结肠癌组织中p73mRNA的表达明显高于癌旁组织 ,免疫组织化学显示 ,48例结肠癌标本中 2 1例呈阳性表达 ,癌旁组织无阳性表达。结肠癌不同临床分期之间以及不同分化程度之间P73阳性表达率有显著差异 (分别为P <0 .0 0 5和P <0 .0 5 )。结论 :结肠癌组织中p73基因过度表达 ,其蛋白表达水平与结肠癌临床分期。

cDNA末端快速扩增法克隆高山离子芥原叶绿酸酯氧化还原酶基因及其表达特异性分析

用cDNA末端快速扩增技术从高山离子芥中克隆得到完整的原叶绿酸酯氧化还原酶(POR,EC:1.3.1.33)基因,命名为CbPORB,DNAMAN软件分析CbPORB和其他几种植物的POR基因,有很高的同源性,将其cDNA序列提交到NCBI数据库(序列接受号为FJ390503)。CbPORB基因全长1444bp,包含1个1209bp的开放阅读框(ORF),编码402个氨基酸的蛋白CbPORB(序列号为ACJ12925)。NCBI数据库在线软件计算高山离子芥CbPORB蛋白的等电点为9.43,推测其相对分子量为43.37kD。组织特异性表达分析显示:CbPORB在叶、茎中表达,根中不表达,具有器官特异性;干旱胁迫处理抑制CbPORB的转录水平;而表油菜素内酯(24-epibrassinolide;EBR)处理提高了CbPORB的转录水平。

基于RT-RAPID和CRISPR-Cas12a的诺如病毒GⅡ.6亚型核酸检测方法的建立

为建立一种特异性强、灵敏度高且简单方便的诺如病毒GⅡ.6核酸快速检测方法,下载诺如病毒GⅡ.6基因组序列,用Mega7.0对基因组进行比对分析获得高度保守序列;基于保守序列设计诺如病毒GⅡ.6的反转录重组酶和聚合酶等温检测(RT-RAPID)技术扩增引物、荧光探针、crRNA和报告分子;优化RT-RAPID的反应引物、反应温度和反应时间及Cas12a检测用的crRNA,并分析RT-RAPID-Cas12a方法的特异性和灵敏度。基于RT-RAPID荧光法和RT-RAPID-Cas12a荧光法的诺如病毒GⅡ.6亚型核酸快速检测方法能在1 h内完成检测并得出结果,灵敏度分别为10 copies/μL和0.5 copies/μL,且两个方法均与诺如病毒GⅡ.17型、鼻病毒、偏肺病毒和博卡病毒无交叉反应。2个检测方法与RT-qPCR阳性样本一致率均为90%,阴性样本一致率均为100%。论文建立的基于RT-RAPID和Cas12a的诺如病毒GⅡ.6核酸快速检测方法均可高效快速地检测出诺如病毒GⅡ.6,具有灵敏度高、特异性强、操作便捷且快速等特点。