荧光定量RT-PCR检测肺癌外周血CEAmRNA

[目的]应用荧光定量逆转录PCR(reversetranscriptasepolymerasechainreaction,RT-PCR)方法检测肺癌外周血中CEAmRNA。[方法]用荧光定量RT-PCR方法检测30例肺癌患者外周血CEAmRNA,并将其在不同临床病理特征下的表达进行统计分析。[结果]30例肺癌患者外周血中CEAmRNA检测阳性11例,阳性率36.7%,外周血CEA的表达与性别、年龄、病理类型、分化程度、分期无关(P>0.05)。[结论]CEAmRNA是检测肺癌微转移的良好标志物,荧光定量RT-PCR法检测肺癌患者外周血CEAmRNA,有助于亚临床转移的早期发现。

应用RT-PCR方法检测腺病毒介导的nm23-H1基因在A549细胞中的表达

目的:应用RT-PCR方法检测腺病毒介导的nm23-H1基因在A549细胞中的表达。方法:制备nm23-H1重组腺病毒并感染人类肺腺癌A549细胞系,用RT-PCR方法检测A549细胞内nm23-H1基因表达量的变化。结果:RT-PCR结果显示,实验组和对照组的A549细胞nm23-H1/β-actin值分别为0.82和0.51(P<0.05)。结论:重组腺病毒载体Adeno-nm23-H1成功介导了A549细胞内nm23-H1基因表达量的上调,为进一步研究nm23-H1抑制肿瘤转移分子机制及基因治疗奠定了基础。

鱼腥草对甲1型流感病毒核蛋白基因作用的实验研究

目的探讨鱼腥草对甲1型流感病毒核蛋白基因的作用。方法在甲1型流感病毒核蛋白基因保守区设计引物,对其进行筛选,同时对荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)条件和反应体系进行优化。设病毒对照组、药物对照组、细胞对照组和实验组,采用荧光定量RT-PCR法测定鱼腥草对甲1型流感病毒基因的效应。结果病毒对照组细胞出现细胞病变(CPE),血凝滴度为阳性,其他组无CPE,血凝滴度均为阴性。以荧光定量RT-PCR法重复5次取平均值,实验组RNA测定结果为(2.6±0.8)×106拷贝数/μgRNA,对照组为(2.9±1.2)×109拷贝数/μg RNA,两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论鱼腥草可抑制甲1型流感病毒核蛋白基因的表达。

大蒜素对人胃癌细胞系MGC-803增殖的影响及其作用机制

目的通过大蒜素作用于人胃癌细胞系MGC-803,探讨其对胃癌细胞增殖的影响及机制。方法通过细胞培养技术检测大蒜素作用胃癌细胞后细胞增殖抑制率;免疫组化及RT-PCR法检测胃癌细胞中p16 INK4因子表达变化。结果大蒜素作用于MGC-803细胞后,对其增殖表现出了明显的抑制作用,且呈浓度依赖性;大蒜素处理的MGC-803细胞p16蛋白及p16 INK4 mRNA表达明显强于未应用大蒜素处理组(P<0.05)。结论大蒜素可以抑制MGC-803细胞的增殖,其机制之一可能为上调了细胞抑癌基因p16 INK4的表达。

胃癌组织中干细胞标志物Sox2的表达及临床意义

目的：探讨胃癌组织中干细胞标志物Sox2的表达及临床意义。方法 RT-PCR检测60例胃癌患者癌组织（胃癌组）和癌旁组织（癌旁组）中Sox2 mRNA表达，免疫组织化学法检测2组Sox2蛋白表达水平。比较Sox2 mRNA阳性表达情况在不同年龄、性别、肿瘤大小、组织类型、TNM分期、分化程度、浸润深度及淋巴结转移中的差异。结果胃癌组Sox2 mRNA阳性表达率53.3%（32/60）高于癌旁组的20.0%（12/60）；Sox2 mRNA的相对表达强度高于癌旁组（0.724±0.209 vs.0.256±0.065，P＜0.01）。胃癌组Sox2蛋白的阳性表达率50.0%（30/60）高于癌旁组的16.7%（10/60，P＜0.01）。胃癌组Sox2 mRNA阳性表达率临床TNM分期（Ⅲ＋Ⅳ）组高于（Ⅰ＋Ⅱ）组，低、未分化组高于中、高分化组，浸润深度T3～T4组高于T1～T2组，淋巴结转移组高于无转移组（均P＜0.05或P＜0.01）。结论胃癌组织中Sox2高表达与其发生、侵袭、进展及转移有关，可作为胃癌诊疗新的分子标志物。

压力性尿失禁患者阴道壁结缔组织MMP-2及其抑制物的表达

目的:探讨女性压力性尿失禁(SUI)患者阴道壁结缔组织中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶组织抑制物-2(TIMP-2)mRNA表达与SUI发病的关系。方法:7例无SUI妇女为对照组(A组),24例有完整随访资料的女性SUI患者的阴道壁结缔组织标本为研究组,分为<60岁组(B组)和>60岁组(C组)。应用逆转录-聚合酶链反应分别检测MMP-2和TIMP-2表达量。结果:SUI组患者的MMP-2均较非SUI组显著升高,差别有显著性(P<0.01),TIMP-2均显著下降,差异有统计学意义(P<0.01)。MMP-2在B组和C组之间的差异无显著性(P>0.05),TIMP-2的mRNA表达量C组较B组显著下降,差别有统计学意义(P<0.01)。MMP-2/TIMP-2从A组到B组再到C组显著升高,A组<B组<C组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:MMP-2升高,对胶原纤维的降解增加;TIMP-2下降,对胶原纤维降解的抑制作用减弱,MMP-2/TIMP-2升高,使得总体上对胶原纤维的降解增强,可能在SUI的发生过程中起重要作用。

络脉舒通对急性心肌梗死急诊经皮冠状动脉介入治疗患者再灌注损伤的作用

目的探讨络脉疏通颗粒对急性心肌梗死急诊经皮冠状动脉介入治疗患者再灌注心肌损伤的保护机制。方法选择ST段抬高的并成功实施经皮冠状动脉介入治疗的急性心肌梗死住院患者。随机分成处理组和对照组,对照组给予常规药物治疗,处理组给予常规药物+络脉疏通治疗,疗程2周。分别于发病后不同时间抽取静脉血,测定白细胞介素6mRNA及高敏C反应蛋白的水平。同时检测二维超声心动图,并观测两组患者经皮冠状动脉介入治疗术后心律失常发生率和心电图ST段回落率。结果两组患者经皮冠状动脉介入治疗术后24h白细胞介素6mRNA及高敏C反应蛋白含量均升高,两组间无差别;心律失常及心电图ST段回落率两组间无差别。而术后7天白细胞介素6mRNA及高敏C反应蛋白含量均较术前明显降低(P<0.01),处理组与对照组比较其含量也降低(P<0.05),心律失常及心电图ST段回落率明显降低(P<0.05),14天后左心室射血分数较对照组明显改善(P<0.05)。结论络脉舒通颗粒可抗心肌缺血再灌注损伤,改善经皮冠状动脉介入治疗术后心肌组织再灌注,降低有关炎症因子表达,改善心功能。

实时荧光反转录聚合酶链式反应检测甲型H1N1流感病毒RNA

目的 快速准确检测甲型H1N1流感病毒,提高流感亚型鉴别诊断水平.方法 采用实时荧光反转录聚合酶链式反应（real-time FQ RT-PCR）检测385例流感患者鼻咽拭子标本和血浆H1N1-RNA.结果 68例患者鼻咽拭子甲型H1N1-RNA阳性率为17.66%,治疗第3、5、7天后甲型H1N1流感患者鼻咽拭子甲型H1N1-RNA阳性阴转率分别为20.51%、66.67%和91.02%,鼻、咽拭子标本检测H1N1-RNA有差异（P〈0.01）,血浆H1N1-RNA检出1例阳性.结论 real-time FQ RT-PCRneng能快速准确检测甲型H1N1流感病毒核酸,有利于早期治疗和疫情控制.

大鼠心脏结后延伸连接蛋白转录表达的定量研究

目的探讨结后延伸连接蛋白40(Cx40)、连接蛋白43(Cx43)和连接蛋白45(Cx45)的表达与房室结折返性心动过速的关系。方法采用激光捕获仪精确分离大鼠心脏结后延伸及其房室结、窦房结、浦肯野纤维和右房肌、右室肌。通过实时荧光聚合酶链反应对3种Cx表达进行定量分析。结果激光捕获成功分离了结后延伸及其他传导细胞和工作肌细胞。Cx在心脏不同区域表达有一定的特异性,但又有明显的分布交叉性。结后延伸Cx表达模式与房室结、窦房结较相近,而和浦肯野纤维、工作肌细胞明显不同。在结后延伸,具有细胞高电导特性的Cx43表达量比工作肌显著减少约25倍(P<0.05),比浦肯野纤维减少约18倍(P<0.05);具有更高电导特性的Cx40显著低于浦肯野纤维,大约减少6.8倍(P<0.01);而具有低电导的Cx45比工作肌相对高表达。结论由于结后延伸相对高表达高阻抗的Cx45,少量表达低阻抗的Cx43和Cx40,使冲动在结后延伸缓慢传导,为房室结折返环路的慢径形成提供了物质基础;折返环路不仅涉及致密结,而且还涉及心房和结后延伸,结后延伸、房室结和心房Cx表达水平即电偶联的强度各异,形成了细胞连接处阻抗的不连续,当在一定条件下有可能形成单向阻滞,导致折返性心律失常的发生。

结直肠癌患者外周血人端粒酶逆转录酶mRNA和MUC1 mRNA的检测及其临床意义

背景:传统影像学检查和血清肿瘤标记物检测对结直肠癌微转移的诊断价值有限。目的:检测结直肠癌患者外周血人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA和MUC1 mRNA表达,探讨两者对结直肠癌微转移的诊断价值。方法:收集53例结直肠癌患者和21名健康人的外周血标本,以实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测hTERT mRNA和MUC1 mRNA表达,分析两者表达与肿瘤临床病理特征的关系。应用接受者操作特征曲线(ROC曲线)分析hTERT mRNA、MUC1 mRNA和两者联合检测对结直肠癌的诊断价值。结果:结直肠癌组外周血hTERT mRNA和MUC1 mRNA表达率和表达水平显著高于正常对照组(P<0.05),两者表达与肿瘤淋巴结转移、血行转移和TNM分期相关(P<0.05)。hTERT mRNA、MUC1 mRNA和两者联合检测诊断结直肠癌的ROC曲线下面积分别为0.806、0.778和0.861,诊断界值为Ct<32。结论:外周血hTERT mRNA和MUC1 mRNA可作为诊断结直肠癌微转移的标记物,以实时荧光定量RT-PCR联合检测两项指标优于单项检测。

大鼠脊髓横断早期比目鱼肌重量与肌球蛋白重链亚型mRNA表达的变化

目的观察大鼠脊髓横断后早期比目鱼肌重量及肌球蛋白重链（MHC）各亚型mRNA表达的变化规律.方法 40只雌性Wistar大鼠随机分为对照组（10只）与脊髓横断7 d组（ST7）、15 d组（ST15）、30 d组（ST30）,各10只,脊髓横断水平T8～T10.分别于横断后7、15、30 d取后肢比目鱼肌称重,采用半定量RT-PCR方法观察MHC各亚型mRNA表达的变化.结果脊髓横断各组比目鱼肌重量均较对照组下降（P＜0.05）.ST15、ST30组比目鱼肌绝对与相对重量均较ST7组下降（P＜0.05）.对照组比目鱼肌只表达MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱa,脊髓横断各组在横断7 d后出现MHC-Ⅱx与MHC-Ⅱb的表达,横断后各时间点MHC-ⅠmRNA的表达持续下调;MHC-Ⅱa与MHC-Ⅱx mRNA的表达持续上调;MHC-Ⅱb mRNA的表达维持在低水平.结论脊髓横断主要在早期影响肌肉的重量;脊髓横断后MHC的表达发生由慢型向快型的转化,MHC随神经肌肉活动的减少表现出可塑性.

尿脱落细胞E2F3 mRNA检测在膀胱癌诊断中的价值

目的探讨检测膀胱癌患者尿液脱落细胞中E2F3 mRNA的表达及意义。方法采用逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测58例膀胱癌患者,15例泌尿外科非肿瘤患者以及10例健康志愿者尿液脱落细胞E2F3mRNA的表达,并与尿脱落细胞学检查相对照。结果用RT-PCR法检测尿脱落细胞E2F3 mRNA用于诊断膀胱癌的敏感性为81.03%,高于尿脱落细胞学检测(41.38%)(χ2=19.206,p<0.05),两种方法诊断膀胱癌的特异性无统计学差异(p>0.05)。不同分化程度及不同临床分期膀胱癌患者之间尿脱落细胞E2F3 mRNA的阳性表达率的差异无统计学意义(χ2=0.517,p>0.05;χ2=0.132,p<0.988)。结论RT-PCR法检测膀胱癌患者尿液脱落细胞中E2F3 mRNA的方法可以作为诊断膀胱癌的无创性方法。

细胞因子IL-1β和TNF-α在恶性脑瘤中mRNA表达的变化及意义

目的:了解IL-1β和TNF-αmRNA在恶性脑瘤表达的变化及意义。方法:应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测36例脑胶质瘤及瘤旁组织、36例脑膜瘤及癌旁组织、20例术中切除标本的距瘤3 cm组织中IL-1β和TNF-αmRNA表达。结果:脑胶质瘤、脑膜瘤组织中IL-1β和TNF-αmRNA表达均显著高于瘤旁组织(P<0.01)。距瘤3 cm以远组织中IL-1β和TNF-αmRNA表达显著低于脑胶质瘤、脑膜瘤组织;而脑胶质瘤、脑膜瘤瘤旁组织IL-1β和TNF-αmRNA表达与距癌3 cm以外组织相比差别无显著性意义(P>0.05)。结论:细胞因子IL-1β和TNF-α的变化可作为观察恶性脑瘤病情及监测反应的一种手段。

大鼠脊髓缺血再灌注损伤后MMP-9的基因表达变化

目的研究脊髓缺血再灌流损伤过程中的脊髓神经细胞MMP-9表达的变化。方法30只成年Wistar大鼠,解剖分离腹主动脉,按缺血和再灌流各时间段分别阻断开放腹主动脉,造成脊髓腰尾段缺血,假手术组不阻断腹主动脉,取缺血前、缺血30min、缺血60min,缺血30min再灌注2、6、10h后,分别造成脊髓缺血再灌注损伤模型,每个时相点5只。对局部脊髓逆转录PCR(RT-PCR)及荧光定量PCR检测基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达水平。结果正常对照组(缺血前)脊髓可见少量MMP-9表达,而实验组(缺血30min、缺血60min)MMP-9基因表达明显增加,再灌注2、6、10h,MMP-9mRNA表达逐渐增加,且MMP-9的基因表达较缺血期明显增加,各组之间存在明显的差异(P<0.05)。结论MMP-9在脊髓缺血再灌注中起一定作用,再灌注期细胞内MMP-9基因表达明显多于缺血期,MMP-9与缺血再灌注时间之间存在时效关系,表明MMP-9可能参与脊髓再灌流损伤,是脊髓再灌注损伤过程中一个重要的病理学环节,研究结果对于揭示脊髓继发性损伤的发病机理具有积极意义。

ARHI基因mRNA和蛋白表达水平与胶质瘤恶性度相关性探讨

目的探讨ARHI基因表达水平与人脑胶质瘤恶性度的相关性。方法采用RT-PCR和Western blot法检测10例正常脑组织、59例胶质瘤组织、4种胶质瘤细胞系(U251,SHG44,BT325,U87)中ARHI基因mRNA和蛋白的表达强度,结合临床病理资料统计分析。结果胶质瘤组织、细胞系中ARHI基因的表达水平显著低于正常脑组织,胶质瘤组织中ARHI的表达水平随肿瘤恶性程度增加而明显降低(P<0.01)。结论 ARHI基因mRNA和蛋白在胶质瘤中低表达,且表达水平与胶质瘤恶性程度负相关,提示ARHI基因低表达对胶质瘤的形成和恶性演变具有重要作用。

乳腺癌患者骨髓中hMAM表达与临床病理学指标的关系

目的:检测乳腺癌患者骨髓中hMAM mRNA表达,判断骨髓微转移与临床病理学指标及预后的关系。方法:采用RT-PCR法检测乳腺癌骨髓组织中hMAM mRNA表达。结果:102例乳腺癌患者骨髓组织hMAM mRNA表达阳性率为37·3%。骨髓微转移率随乳腺癌肿块的增大而增高,χ2=15·34,P=0·000;临床分期越晚,骨髓微转移率越高,χ2=10·91,P=0·004;组织学分化越差,骨髓微转移率越高,χ2=7·80,P=0·020;浸润性导管癌和浸润性小叶癌的骨髓微转移率较低度恶性乳腺癌组高,χ2=6·40,P=0·041;骨髓微转移与淋巴结转移状况、年龄及月经状况无关,χ2值分别为2·68、1·30、2·54,P值分别为0·101、0·255、0·111。乳腺癌骨髓微转移阳性者易发生远处转移,P=0·049。结论:乳腺癌骨髓微转移与肿瘤大小、临床分期和组织学分级有关;微转移阳性者发生远处肿瘤转移的机会高、预后差;微转移检测可以作为判断乳腺癌预后的指标之一。

变应性鼻炎患者外周血中神经营养因子mRNA的表达

目的检测变应性鼻炎患者外周血中神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)mRNA的表达水平,并分析基因表达与鼻炎病情严重程度的关系。方法采用成组对照试验,抽提变应性鼻炎患者外周血总RNA,以正常成人为对照组。使用实时定量RT-PCR检测NGF、BDNF、NT-3mRNA的表达水平,2-ΔΔCt法计算实验组基因表达的变化倍数。结果相较于正常成人,变应性鼻炎患者的外周血中NGF、BDNF、NT-3mRNA的2-ΔΔCt值依次为2.4368、4.4588、1.7818;NT-3mRNA表达的2-ΔΔCt值随着鼻炎严重程度加重呈递增趋势。结论相较于正常成人,变应性鼻炎患者外周血中NGF、BDNF、NT-3mRNA的表达量上调,可能与变应性鼻炎发病有关;NT-3可作为评价变应性鼻炎严重程度的分子生物学指标。

大鼠缺血预处理对心肌保护作用及脂联素表达的影响

目的探讨心肌缺血预处理(IPC)对成年和老年大鼠的心功能及心肌组织和血浆中脂联素表达的影响。方法取成年和老年大鼠各85只,将IPC成功的成年和老年大鼠各50只中,随机各取40只为IPC组,另10只再建心肌梗死(M1)模型为IPC-M1组;只穿线不阻断血流的成年和老年大鼠各30只中,随机各取20只作为假手术组,另10只建MI模型为单纯MI组。假手术组及IPC组又分别于IPC后0、6、12和24h 4个时间点观察。将未结扎冠状动脉的成年和老年大鼠各5只作为对照组。用M型超声检测心功能,Masson's Trichrome染色,测量MI面积,免疫组织化学法和RT-PCR法测心肌组织脂联素蛋白和mRNA的表达,用ELISA法检测血浆脂联素含量。结果老年大鼠IPC-MI组存活率显著低于单纯MI组和对照组(P<0.05),而成年大鼠3组生存率无变化(P>0.05)。成年大鼠IPC-MI组短轴缩短率较单纯MI组明显升高,MI面积显著减小(P<0.05);与假手术组比较,IPC组6和12h心肌组织脂联素mRNA表达明显升高(P<0.05),血浆脂联素在0、6和12h显著升高(P<0.05)。老年大鼠IPC组各时间点心肌组织脂联素mRNA表达与假手术组无显著差异,血浆脂联素24 h明显升高(P<0.05)。结论成年大鼠IPC后心肌组织和血采脂联素表达均升高,心功能改善,老年大鼠脂联素变化不明显,提示脂联素参与成年大鼠IPC发挥的心肌保护作用。

Rhobtb2基因在多种肿瘤细胞中的表达及意义

目的探讨R hob tb2基因在多种肿瘤细胞中的表达及意义。方法以胎儿脑组织及人胚肺细胞为正常组织或细胞对照,选用八种不同组织的肿瘤细胞,用逆转录-聚合酶链反应法检测其R hob tb2基因表达。结果R hob tb2基因在乳腺导管癌细胞株T-47D中表达缺失,在乳腺腺癌细胞株M CF-7、SK-BR-3,以及卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、胃癌细胞中均有表达。筛选出R hob tb2基因表达缺失的乳腺癌细胞系T-47D,为R hob tb2基因功能研究提供基础和理想模板。结论R hob tb2基因可能以组织特异性或细胞特异性方式发挥抑癌基因作用。

兔角膜缘干细胞标志物α-烯醇化酶的表达与增龄的关系

目的了解角膜缘干细胞标志物α-烯醇化酶表达随着增龄的变化情况。方法选取新西兰白兔3月龄(青年组)、18月龄(中年组)和36月龄(老年组)各10只的角膜上皮组织,DMEM/F12培养液培养角膜缘干细胞。半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测α-烯醇化酶mRNA含量。结果α-烯醇化酶mRNA含量均数青年组为1.49,中年组1.33,老年组0.92,三组比较差异有统计学意义(F=289.981,P<0.01)。α-烯醇化酶mRNA月平均下降速度均数中年组为0.010,老年组0.023,两组比较差异有统计学意义(t=-7.860,P<0.01)。结论随着增龄,角膜缘干细胞α-烯醇化酶mRNA含量逐渐降低,α-烯醇化酶mRNA月平均下降速度表现为一个非线性的过程。