lgtF,rfaF和rfaD基因在副猪嗜血杆菌LOS诱导BALB/c小鼠炎性因子表达中作用的研究

为了研究lgtF,rfaF和rfaD基因在副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)脂寡糖(LOS)刺激BALB/c小鼠炎性因子IL-1α、IL-6、IL-8和TNF-α表达中的作用。提取HPS SC096株、lgtF基因缺失株(ΔlgtF)、rfaF基因缺失株(ΔrfaF)和rfaD基因缺失株(ΔrfaD)的LOS,用80μg HPS-LOS,ΔlgtF-LOS,ΔrfaF-LOS和ΔrfaD-LOS腹腔注射BALB/c小鼠,分别在6 h和12 h后去眼球采血,分离血清,运用商品化的ELISA试剂盒检测炎性因子IL-1α、IL-6、IL-8和TNF-α的表达量变化。结果表明用80μg HPS-LOS刺激BALB/c小鼠6 h和12 h后IL-1α、IL-6、IL-8和TNF-α的表达量均升高,显著高于ΔlgtF-LOS,ΔrfaF-LOS和ΔrfaD-LOS刺激BALB/c小鼠后的IL-1α、IL-6、IL-8和TNF-α的表达量(P<0.05)。以上实验结果首次证实了lgtF、rfaF和rfaD基因在HPS LOS刺激BALB/c小鼠炎性因子表达过程中起着重要的作用。

副猪嗜血杆菌rfaD基因的克隆及原核表达

rfaD基因编码ADP-L-甘油-D-甘露庚糖-6-异构体酶,缺失该基因会导致LOS糖链缩短和疏水性增强,从而影响细菌的致病性。为进一步探索副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)ADP-L-甘油-D-甘露庚糖-6-异构体酶的功能,本研究对Hps SC096株rfaD基因进行克隆及原核表达。根据GenBank上登录的NC_011852序列,设计引物扩增rfaD基因,获得927bp目的片段,将其克隆至pMD19-T载体。经送样测序鉴定正确后,连接到pET-32a(+)上进行原核表达,并用IPTG诱导,将诱导产物进行SDS-PAGE和Western blotting分析。SDS-PAGE结果显示,H.parasuis rfaD基因能在E.coli BL21(DE3)中表达,重组蛋白分子质量约为50ku,与预期分子质量大小一致。Western blotting分析结果表明,该蛋白质能与H.parasuis血清4型阳性高免血清产生特异性结合反应,具较好的反应原性。