液质联用技术(LC-MS)在rh-PTH(1-34)肽图确定中的应用

目的:建立可用于质量控制的 rh-PTH(1-34)的标准胰酶肽图分析方法,并确定其理论肽图。方法:用胰酶动态酶切rh-PTH(1-34)探索最佳肽图分析条件,利用氨基酸特征吸收波长色谱分析结合 LC-MS 相对分子质量分析确证理论肽图。结果:多批 rh-PTH(1-34)原液经胰酶解、RP-HPLC 分析后,可产生4个主要肽段,其图谱与人工合成的 hPTH(1-34)对照品一致;确定其理论肽图为:T_1—HLNSMER、T_2—LQDVHNF、L_3—VEWLR、T_4—SVSEIQLMHNLGK。结论:建立的胰肽图分析方法可用于 rh—FFH(1—34)产品的质量控制,用氨基酸特征吸收波长分析辅助 LC-MS 相对分子质量分析可有效用于 rh-PTH(1-34)的标准肽图确定。

重组人甲状旁腺素rh-PTH(1-34)结构类似物纯度的质量研究

目的:对重组人甲状旁腺素rh-PTH(1-34)结构类似物(以下简称rhPTH′)的纯度进行质量控制,为其生产工艺提供实验室研究依据。方法:采用聚丙烯酰胺小肽凝胶电泳(SDS-PAGE)、等电聚焦电泳(IFE)、氨基酸组成分析和反相高效液相色谱法(RP-HPLC)对制备的rhPTH′的纯度等进行质量鉴定,并配合质谱法测定样品的精确相对分子质量。结果:经鉴定酸水解后目的蛋白纯度为89.2%;离子交换层析后样品纯度经电泳和HPLC鉴定分别为100%和94.9%;样品等电点为9.05,与理论值基本一致;氨基酸组成与理论组成相同,质谱鉴定相对分子质量为4663.76,与理论值4664.01相差0.25。结论:用现有生产和纯化工艺制备的rhPTH′具有较高的纯度,质量符合要求。

重组人甲状旁腺激素的质量研究

目的:建立重组人甲状旁腺激素rh—PTH(1—34)的质控方法和标准规范,为质量标准的制定提供科学依据。方法:用UMR-106-01细胞株/RIA法测定人甲状旁腺激素的生物学活性,RP—HPLC法测定含量;胰酶消化及RP—HPLC法测定肽图;IEF凝胶电泳测定等电点;用质谱及还原型SDS—PAGE电泳测定相对分子质量;分别用非还原型SDS—PAGE和RPHPLC法测定样品的纯度;用ELISA法测定产品的肠激酶(EK)残留。结果:6批rh—PTH(1—34)产品原液比活性分别为:1.2×10~4,1.2×10~4,9.2×10~3,1.2×10~4,9.2×10~3,1.1×10~4IU·mg^(-1)蛋白;其蛋白含量分别为:0.734,0.685,0.597,0.970,0.960,0.920 mg·mL^(-1);6批成品效价分别为标示量的:119%,115%,95%,100%,100%,96%。RP—HPLC胰肽图显示4个肽段,6批样品图谱均一致;N-末端15个氨基酸序列与理论值一致;其等电点范围为8.0-9.0。SDS—PAGE和RP—HPLC纯度均大于95.0%。结论:建立的质控方法可有效控制重组人甲状旁腺激素rh—PTH(1—34)产品的质量。

重组人甲状旁腺激素安全性药理学研究

目的:观察重组人甲状旁腺激素(rh-PTH)对大鼠心血管、呼吸系统和对小鼠神经系统的影响。方法:大鼠实验分高、中、低3个剂量及空白对照共4个组,给药组分别单次及连续7d皮下注射rh-PTH 160,80和40μg·kg^(-1),对血压、心电图(ECG)、呼吸频率及节律进行观察。小鼠实验分高、中、低3个剂量及空白对照共4个组,给药组分别单次及连续7d皮下注射rh-PTH 320,160,和80μg·kg^(-1),对动物自发活动和爬杆能力进行观察。结果:单次及连续7d皮下注射rh-PTH使大鼠收缩压、舒张压、平均动脉压降低,心率增加,且存在量效关系,但2h后上述指标基本恢复正常。对心律、ECG之QRS时间、T波、ST段、呼吸频率、节律和幅度无明显影响。对小鼠自发活动和爬杆能力无明显影响。结论:rh-PTH对心血管系统有一定影响,可使收缩压、舒张压、平均动脉压降低,心率增加。

rhPTH加速上颌前部截骨术后正畸牙移动中的实验研究

目的:研究重组人甲状旁腺激素(recombinant human parathyroid hormone,rhPTH)促进上颌前部截骨术后正畸牙移动的可行性及其调控机制。方法:48只兔建立上颌前部截骨术及右侧上颌第一磨牙正畸移动模型,随机分成实验组和对照组。实验组术后隔日皮下注射rhPTH 20μg/kg;对照组隔日皮下注射等量生理盐水。2组分别于第5、7、14及21天测量右侧上颌第一磨牙向近中移动的距离,并取移动牙近中牙周组织行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色破骨细胞计数、免疫组化和荧光定量PCR检测骨硬化蛋白(sclerostin,SOST)、骨形态蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)的表达及变化。结果:在同一时间段,实验组右上颌第一磨牙移动距离及速度均快于对照组(P<0.05)。实验组右上颌第一磨牙的近中牙周组织中表达的破骨细胞计数明显大于对照组(P<0.05)。免疫组化和荧光定量PCR(fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测发现,实验组右上颌第一磨牙近中牙周组织中SOST mRNA及蛋白的表达明显大于对照组(P<0.05);而实验组BMP-2 mRNA及蛋白的表达则低于对照组(P<0.05)。结论:隔日皮下注射rhPTH可能通过上调正畸牙近中压力侧SOST的表达,下调BMP-2的表达,增加牙槽骨的改建从而加快上颌前部截骨术后正畸牙的移动速度。

重组人甲状旁腺激素(1-84)的质量研究

目的:对重组人甲状旁腺激素rh-PTH(1-84)进行质量研究,为其生产工艺的进一步优化提供依据。方法:采用RP-HPLC和非还原型SDS-PAGE测定纯度;还原型SDS-PAGE测定相对分子质量;Western blot鉴定并进行N-末端氨基酸序列测定;考马斯亮兰法测定蛋白含量;ELISA法测定效价。结果:rh-PTH(1-84)经RP-HPLC和SDS-PAGE分析,其纯度分别为81%,85%。其相对分子质量为9480,N-末端15个氨基酸序列为SVSEIQLMHNLGKHL,均与理论值一致。蛋白含量为标示量的87%,效价在标示量的80%～120%。结论:重组人甲状旁腺激素rh-PTH(1-84)质量基本符合规定,但其纯度偏低,生产工艺有待进一步优化。