应用抑制性消减杂交技术筛选rhALR调节基因

目的:筛选与克隆重组人肝再生增强因子激活基因,了解其在体内的调节功能线索及机制.方法:应用大肠杆菌系统,表达、纯化重组人肝再生增强因子蛋白.刺激HepG2细胞,以溶剂PH7.8的磷酸盐缓冲液为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建重组人肝再生增强因子激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到30个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000bp插入片段.对插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得19种编码基因,包括15种已知基因和4种未知基因.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、肿瘤免疫发生及物质代谢密切相关的蛋白编码基因,推测了重组人肝再生增强因子在体内可能存在的调控机制的线索,尚需进一步的实验证明.

一组抗重组人肝再生增强因子单克隆抗体的制备与鉴定

目的 :制备抗重组人肝再生增强因子 (rhALR)单克隆抗体 (McAb)。方法 :以纯化的rhALR为抗原免疫小鼠 ,取其脾细胞与SP2 /0细胞融合 ,以ELISA ,Westernblot法分别筛选测其滴度及免疫特异性。结果 :获得 2株稳定分泌抗rhALR单克隆抗体杂交瘤株。其效价 ,腹水 10 -3 - 10 -5,培养上清 10 -2 - 10 -3 ,两株McAb针对不同抗原决定簇。结论 :制备的抗体具有高特异性。对rhALR在体内组织器官的分布 。

聚苯乙烯微孔板的表面修饰对酶免疫结果的影响

目的对聚苯乙烯板(PS)进行适当的修饰处理,以改善酶免疫分析的测定效果。方法以辣根过氧化物酶(HRP)为固相分子,用以观察酶与特异性底物之间的相互作用;用重组人增强肝脏再生因子(rhALR)、双链DNA(dsDNA)、心磷脂为包被抗原,以未氧化型与氧化型抗ALR为包被抗体,分别固定于不同修饰的PS板表面进行酶免疫分析,并与未经修饰处理的PS板作对比研究。结果生物分子的固定效果除与固相表面特征不同有关外,还与其本身的性质、所处的物理状态(包括分子的种类、结构、分子量大小和表面电荷等)密切相关。其中APTES与PLL修饰表面可显著改善rhALR、dsDNA、心磷脂抗原及氧化型抗体分子的固相化效果,提高酶免疫分析的吸光度值和测定敏感度。UV辐照PS板用于抗ALR和抗dsDNA抗体,醛基化表面(GA修饰)用于抗心磷脂抗体的测定亦可获得较高的特异信号显示与低背景噪音。AFM表征结果显示:疏水物理吸附的生物分子分布是随机和不规则的,且为聚集成团分布;而电荷引力与共价结合模式固定的生物分子空间取向与分布较为均一,可提高固定生物分子的数量和功能化保留程度。结论PS板经修饰处理后可改善对免疫分子的吸附能力,基于共价键和电荷引力结合模式可获得较为满意的酶免疫测试效果。

重组人肝再生增强因子的纯化及生物学活性分析

目的 对在大肠杆菌中表达的重组人肝再生增强因子（rhALR）进行分离纯化及生物学活性分析.方法 以大肠杆菌DH5α发酵表达重组人肝再生增强因子,经包涵体洗涤、变性、目的蛋白复性,以离子交换、分子筛等技术纯化,并进行一系列检定.结果 目的 蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性及柱层析纯化,纯度大于98%,SDS-PAGE测定相对分子质量为30 000,MOLDI-TOF-MS测定其相对分子质量为30 780.522,N-末端15个氨基酸与理论序列一致.Western blot证实rhALR正确表达,等电点5.85～6.85,氨基酸含量与理论值基本符合.动物实验证实rhALR具有明显的促进CCl4毒性肝损伤小鼠肝细胞修复活性.结论 经柱层析纯化的rhALR具有促进小鼠CCl4肝损伤肝细胞修复的活性.

重组人肝再生增强因子抗肝损伤作用

重组人肝再生增强因子抗肝损伤作用杨晓明王爱民周平王清明吴祖泽贺福初肝再生增强因子（ＡＬＲ）是从新生大鼠肝组织中克隆到的一种肝增殖刺激因子，它在体内能促进肝细胞增殖［１］，其特异ｍＲＮＡ的表达与大鼠肝部分切除后肝细胞ＤＮＡ合成密切相关［２］，并能显著提...