rhBMP-4与rhIGF-Ⅰ联合应用对人牙周膜成纤维细胞增殖及分化能力的影响

目的:探讨rhBMP-4与rhIGF-Ⅰ联合应用对人牙周膜成纤维细胞增殖及分化能力的影响。方法:将人牙周膜成纤维细胞分别与10ng/ml rhBMP-4、10ng/ml rhIGF-Ⅰ、10ng/ml rhBMP-4+10ng/ml rhIGF-Ⅰ、无血清DMEM共同培养3d,用MTT法测定细胞增殖情况,用碱性磷酸酶试剂盒检测细胞碱性磷酸酶的活性,用羟脯氨酸试剂盒检测细胞分泌Ⅰ型胶原的量。结果:第3天,10ng/ml rhBMP-4+10ng/ml rhIGF-Ⅰ组人牙周膜成纤维细胞的生长增殖能力最强,并与其它3组比较有显著性差异(P<0.05),但其增强细胞碱性磷酸酶的活性及促进细胞分泌Ⅰ型胶原的能力并不比两者单独作用强。结论:rhBMP-4与rhIGF-Ⅰ联合应用,能协同促进人牙周膜成纤维细胞增殖,但不能协同促进细胞分化。

大肠杆菌中高效表达rhBMP-4的探讨及初步活性测定

目的:在大肠杆菌中表达具有生物活性的rhBMPBMP4。方法:在不改变氨基酸序列的前提下,以全基因合成的方式对人BMP4成熟肽基因全长进行定点突变,将之重组入pET3c表达载体并转化至大肠杆菌BL21(DE)plysS。IPTG诱导和包涵体复性后,利用C2C12细胞横向成骨细胞分化实验以及小鼠肌袋异位骨形成实验检测其活性。结果:获得0.348kb的BMP4DNA序列,表达的目的蛋白主要以包涵体的形式存在。经纯化及复性后,体内与体外的活性检测表明rhBMP4有良好的诱骨生成活性。结论:该方案能够实现rhBMP4在大肠杆菌中的高效表达。

DPP-rhBMP-4m融合表达载体的构建和应用

目的:构建容易去除标签蛋白的大肠杆菌融合蛋白表达载体.方法:PCR方法获得带有Asp-Pro-Pro前缀的重组人骨形态发生蛋白-4成熟肽(recombination human bone morphogenetic protein 4 mature peptide,rhBMP-4m)编码序列并克隆入pRSET载体,转化大肠杆菌后诱导表达;经免疫印迹法鉴定融合蛋白;甲酸裂解去除6His标签后细胞学实验检测其活性.结果:构建的融合表达载体序列测定结果与预期结果一致;诱导表达的DPP-rhBMP-4m融合蛋白以包涵体形式存在,占菌体总蛋白量的37%,亲和层析后目的蛋白纯度为97%;免疫印迹法鉴定显示,该融合蛋白可与相应抗血清产生特异性反应;对C2C12细胞具有良好的生物活性.结论:成功构建了利于目的蛋白纯化的pRSET-DPP-rhBMP-4m融合表达载体.

rhBMP-2对兔下颌骨牵引成骨的影响及BMP-4的表达

目的通过观察兔下颌骨牵引成骨过程,探讨不同剂量重组人骨形成蛋白2(rhBMP-2)在不同时间对成骨区新骨生成的影响及其BMP-4的表达。方法日本大耳白兔48只行单侧下颌骨牵引,分别将不同剂量rhBMP-2胶原复合物植入骨切开处,间歇期5 d,牵引速度0.4 mm/d,2/d,共牵引5 d。用免疫组化方法观察牵引成骨新骨生成区BMP-4在固定1、7、14、28 d时的表达及新骨生成情况。结果随着稳定期延长,牵引间隙内新骨逐渐生成。1.5 mg BMP-2剂量组的新骨生成优于对照组,3 mg BMP-2剂量组的新骨组织在同一时期内最多。BMP-4主要定位于成骨细胞和软骨细胞中,表达高峰出现在稳定期的1、7 d,此后逐渐下降,第28天阳性表达微弱。结论rhBMP-2能促进牵引成骨,并具有浓度依赖性,BMP-4可能在牵引成骨的早期发挥重要作用。

人重组骨形成蛋白-4对人牙周膜成纤维细胞增殖及分化能力的影响

目的探讨人重组骨形成蛋白-4（rhBMP-4）对人牙周膜成纤维细胞生长增殖及分化的影响。方法选取因正畸需要拔除的第一前磨牙，刮取根中1／3牙周组织作为标本，采用牙周膜细胞体外培养技术培养牙周膜成纤维细胞，将浓度为5，10，20，40ng／ml的rhBMP-4与牙周膜成纤维细胞共同培养5d，用MTT法测定细胞增殖情况，用碱性磷酸酶试剂盒检测牙周膜成纤维细胞碱性磷酸酶的活性。结果第1，3，5天，5—20ng／ml的rhBMP-4对牙周膜成纤维细胞的生长增殖能力及碱性磷酸酶活性的影响与对照组比较差异均有显著性（P〈0．05）。结论在一定时间范围内，rhBMP-4对牙周膜成纤维细胞生长增殖及分化有促进作用。

重组人骨形成蛋白-4的大规模制备

含有能够高表达重组人骨形成蛋白成熟肽(recombinant human bone morphogenetic protein 4 mature peptide,rhBMP- 4m)质粒的工程菌株,导入15 L NBS发酵罐中进行恒溶氧高密度发酵和诱导表达,测定发酵菌液OD600值为30．8。离心收集菌体, PAGE电泳后光密度扫描表明hBMP-4m占细菌总蛋白量的42％。悬浮所收集的菌体,裂菌,洗涤4次后的包涵体中hBMP-4m占蛋白量的83．2％。预先取少量样品进行探索实验后,全部包涵体用8 mol尿素缓冲液溶解,上SP-Sepharose FF阳离子柱,以0.35 mol NaCl洗脱,获得纯度为96％的hBMP-4m。其收获量为1．34g/L发酵液;收得率为36．4％。结果表明:使用这套工艺流程大规模制备hBMP-4m,能够得到较好的收得率、较高的收获量和纯度。