rhEPO-Fc融合蛋白质量标准的研究

目的:本研究采用的rhEPO-Fc融合蛋白是首次将编码人IgG Fc段的基因与编码人EPO的基因片段连接,并将其克隆至高表达质粒载体中,用该质粒转染CHO细胞进行分泌表达所得。通过对rhEPO-Fc融合蛋白的质量检验和实验方法参数的选择,建立rhEPO-Fc融合蛋白的质量标准。方法:采用细胞MTT比色法及Human EPO ELISA试剂盒测定rhEPO-Fc的体外生物学活性,Lowry法测定蛋白含量,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量,高效液相色谱法(HPLC)测定纯度,紫外分光光度法测定紫外吸收光谱,地高辛(DIG)标记的核酸探针法测定外源性DNA残留量,等电聚焦电泳法测定等电点,间苯二酚显色法测定唾液酸(SA)含量。结果:rhEPO-Fc的比活性为1.1×105IU/mg蛋白,蛋白含量为1.58mg/ml,相对分子质量约为59000道尔顿,纯度超过99.0%,紫外最大吸收峰约在280nm波长处,外源性DNA残留量小于10pg/mg,等电点为4.5～6.5,唾液酸含量为11.92mol/mol蛋白质。结论:所建立的质控方法已用于rhEPO-Fc制品的检定,可以有效地控制rhEPO-Fc制品的质量。

rhEPO-L-Fc融合蛋白的表达、生物活性和初步药动学分析

为了延长人促红细胞生成素(hEPO)体内半衰期以达到更好的药效,制备通过柔性接头相连接的重组人红细胞生成素-IgG1 Fc融合蛋白(rhEPO-L-Fc),并对其生物学活性和体内药动学进行初步研究。利用PCR技术构建rhEPO-L-Fc融合基因,克隆至表达载体pOptiVEC-TOPO?,在二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-dhfr?)表达。Protein A亲合层析柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE、质谱、Western blotting鉴定表达产物,细胞增殖实验检测融合蛋白的体外活性,动物实验检测融合蛋白的体内活性和半衰期。成功构建pOptiVEC-TOPO?-rhEPO-L-Fc重组子,实现了在CHO细胞表达,纯化后的rhEPO-L-Fc融合蛋白经鉴定,其分子量和特异性均与理论值相符,能刺激体外培养的EPO依赖型细胞生长,ED50为2 ng/mL,且明显增加大鼠外周血网织红细胞数,体内消除半衰期达到27 h。rhEPO-L-Fc融合蛋白能延长hEPO体内半衰期,为其临床研究奠定了基础。