不同rhFSH在辅助生殖技术中的应用及妊娠影响因素分析

目的探讨不同rhFSH在辅助生殖技术中的应用价值及妊娠影响因素。方法选取50例接受辅助生殖技术的患者为研究对象,随机分为两组,各25例。对照组采取rhFSH治疗,研究组采取高纯度rhFSH治疗,比较两组的优质胚胎数、优质囊胚数及性激素水平,同时分析妊娠的影响因素。结果两组优质胚胎数、优质囊胚数比较差异无统计学意义(P>0.05);多因素分析结果显示,卵泡刺激素、雌二醇、孕酮、年龄、rhFSH是妊娠的影响因素(P<0.05)。结论不同rhFSH在辅助生殖技术中均有应用价值,可提高妊娠成功率、胚胎数及囊胚数,改善性激素水平,但需要注意的是,rhFSH治疗期间影响妊娠的因素较多,临床需重点加强高危人群管理,提高妊娠成功率。

rhFSH对雄激素致不孕大鼠局灶性脑缺血大脑皮质AKT及PDGF-B基因表达的影响

目的探讨重组人促卵泡激素(rhFSH)对雄激素致不孕大鼠局灶性脑缺血大脑皮质AKT及PDGF-B基因表达的影响。方法建立雄激素致不孕大鼠(ASR)模型,给予rhFSH后应用线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型。48只大鼠随机分为ASR+假手术(sham)组、ASR+rhFSH+sham组、ASR+M CAO组及ASR+rhFSH+MCAO组,每组12只。采用Longa法进行神经行为评分。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测脑皮质AKT及PDGF BmRNA的表达。结果 ASR+MCAO组大鼠出现明显的神经运动功能障碍体征,缺血侧大脑皮质AKT mRNA的表达降低,PDGF-B mRNA表达上调,而ASR+rhFSH+MCAO组大鼠神经运动功能障碍体征明显减轻,AKT及PDGF-B的表达均明显上调。结论 rhFSH可能通过对AKT及PDGF的调节,促进血管增生以及重塑,导致细胞存活增多,从而减轻脑损伤。

rhFSH干预对玻璃化冻融小鼠卵巢中葡萄糖神经酰胺转移酶表达及卵泡凋亡的影响

目的通过观察重组人卵泡刺激素(rh FSH)干预对玻璃化冻融小鼠卵巢中葡萄糖神经酰胺转移酶(UGCG)表达以及卵泡凋亡的影响,提供rh FSH降调神经酰胺的含量从而达到抗凋亡作用的实验室依据。方法将4周龄C57BL/6J小鼠卵巢随机分为三组:新鲜对照组(FCG)、玻璃化冻存对照组(VCG)、300 IU·L^(-1)rh FSH干预玻璃化冻存组(rh FSH-VG)。通过对冻融卵巢内各级卵泡计数、免疫组织化学技术及Western blot技术,观察并分析各组卵巢内葡萄糖神经酰胺转移酶(UGCG)、抗凋亡蛋白Bcl2和促凋亡蛋白Bax在卵巢不同细胞中的定位和蛋白表达量。结果与FCG组相比,两个冻融组卵巢结构较疏松,但rh FSH-VG组卵泡基质结构较VCG组整齐且较致密。原始卵泡、初级卵泡、正常卵泡和卵泡总数的计数及UGCG和Bcl2的表达显示,rh FSH-VG组高于VCG组(P<0.05),但这两个冻融组均低于FCG组(P<0.05)。闭锁卵泡计数和Bax的表达显示rh FSH-VG组低于VCG组(P<0.05),但这两个冻融组均高于FCG组(P<0.05)。结论玻璃化冻融过程中添加rh FSH可以上调UGCG和Bcl2的表达,下调Bax表达,提示其可能通过降调神经酰胺的含量从而达到抗凋亡目的。

重组人促卵泡激素(rhFSH)制剂的SDS-PAGE/Western blot鉴别方法研究

目的:建立可用于不同剂型重组人促卵泡激素(rhFSH)产品质量控制的特异性SDS-PAGE/Western blot鉴别方法。方法:用SDS-PAGE电泳分离由不同生产企业生产的不同剂型rhFSH产品,通过半干电泳将凝胶上的待测蛋白转移至硝酸纤维素膜(NC膜),采用特异性抗体在NC膜上进行免疫杂交。通过检测灵敏度、线性和专属性试验,进行方法学考察。结果:对rhFSH特异性检测灵敏度可达5ng;对3个厂家生产的3种注射液、1种注射用冻干制剂检测,均可得到阳性结果,且试验结果不受不同剂型中的防腐剂、稳定剂和其他辅料干扰;用本法对等量的其他重组糖蛋白激素如重组人促黄体激素(rhLH)、重组人绒促性素(rhCG)测定结果均为阴性。结论:本方法灵敏度高、专属性强,可作为rhFSH的特异性鉴别方法,用于不同剂型rhFSH产品的质量控制。

DMB衍生-高效液相色谱法测定重组人促卵泡激素中的唾液酸含量

目的建立采用4,5-亚甲二氧基-1,2-苯二胺二盐酸盐(DMB)衍生-高效液相色谱-荧光检测器(HPLCFLD)法(DMB衍生法)同时测定重组人促卵泡激素(rhFSH)中2种唾液酸组分N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)和N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)含量的方法。方法将DMB衍生法与邻苯二胺衍生-高效液相色谱法(邻苯二胺衍生法)进行对比研究,对DMB衍生法中的水解条件进行优化并确定最终方法为rhFSH原液经酸水解后,采用DMB进行衍生,经Agilent ZORBAX 300SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)分离,采用荧光检测器检测。结果与邻苯二胺衍生法相比,DMB衍生法能够实现Neu5Gc与Neu5Ac相关杂质的有效分离。该方法Neu5Gc和Neu5Ac分别在0.5~5.0μg·mL^(-1)(r=0.9999)和25~250μg·mL^(-1)(r=0.9998)浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系;Neu5Gc和Neu5Ac的检测限分别为11.07、10.30 ng·mL^(-1),定量限分别为33.21、20.60 ng·mL^(-1),两者回收率分别为(99.63±1.33)%(n=9)和(100.62±1.58)%(n=9),RSD分别为1.3%(n=9)和1.5%(n=9)。结论该方法专属性强、灵敏度高、精密度和准确度良好,可用于准确测定rhFSH中唾液酸Neu5Gc和Neu5Ac的含量。

重组人促卵泡激素研究进展

重组人促卵泡激素(rhFSH)是目前人类辅助生殖技术中常用的药物。由于糖基化作用的原因,原核表达系统难以生产出rhFSH。迄今为止,全球仅有两家公司的rhFSH药物上市。rhFSH高表达细胞株的构建、蛋白产量的提高以及糖基化的均一性是目前需要重点解决的问题。本文综述了rhFSH及其突变体的研发现状和未来的发展趋势,为后续的重组卵泡刺激素研究奠定基础。

柱前衍生化反相高效液相色谱法定量测定重组人促卵泡激素中的单糖

目的:建立柱前衍生化反相高效液相色谱法定量测定重组人促卵泡激素(rhFSH)中的单糖。方法:采用20%TFA 水解rhFSH,释放单糖,用邻氨基苯甲酸衍生化,采用反相高效液相色谱法测定。色谱柱为 Jupiter C_(18)柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相 A 为含0.15%正丁胺、0.25%磷酸、0.5%四氢呋喃的水溶液,流动相 B 为流动相 A 与乙腈比例为1:1的溶液,梯度洗脱,流速0.85 mL·min^(-1);柱温30 ℃;荧光检测器:激发波长为230 nm,发射波长为425 nm。结果:葡萄糖胺、半乳糖、甘露糖、岩藻糖进样量分别在0.39～3.94 nmol(r=0.9994),0.29～5.85 nmol(r=0.9998),0.24～4.90 nmol(r=0.9998),0.05～1.03nmol(r=0.9996)范围内与峰面积呈良好的线性关系。平均加样回收率(n=9)分别为104.1%,104.2%,104.2%,98.0%;RSD 分别为9.3%,1.8%,0.61%,6.0%。结论:该方法灵敏,专属性强,重复性好,可定量测定重组人促卵泡激素中的单糖。

促卵泡激素体内生物活性测定及其各国药典方法比较

目的：基于长期大量实验数据，对各国药典促卵泡激素（FSH）生物活性测定方法进行梳理、比较。方法：对中国药典2010年版（ChP2010）FSH生物测定法优化，测定国内外多批重组人促卵泡激素（rhFSH）、尿源FSH及复方rhFSH—rhLH产品的体内生物活性，并就动物数、大鼠体重、溶媒中HCG含量、给药剂量、反应值等与EP7．0和USP35-NF30的FSH的生物测定方法进行对比，梳理其异同。结果：ChP2010每组8只动物与EP7．0和USP35-NF30每组5只动物，计算效价结果总平均偏差率为2．3％，总平均可信限率由21．2％升至28．7％，都在生物测定误差允许范围内。ChP2010规定雌大鼠出生19～23d，体重36。50g，体重偏小，实验灵敏度差，体重36～40g的大鼠卵巢增重明显小于40—50g的空白组卵巢增重（P〈0．05）；溶媒中HCG含量也偏低；给药剂量与EP7．0和USP35-NF30相近；卵巢重作为反应值与EP7．0和USP35-NF30器官系数作为反应值不同，两者测定结果间差异无显著性意义。结论：每组5只大鼠即可满足实验要求，减少实验动物用量（3R原则）。大鼠出生21—23d，体重应为40—60g（最大相差10g内），溶媒中HCG含量适当增加至25～30Iu·mL^-1为最佳FSH生物测定实验条件，优化ChP2010的FSH生物测定法。

重组人促卵泡激素低剂量递增方案联合宫腔内人工授精临床分析

目的:探讨重组人促卵泡激素(rhFSH)低剂量递增方案联合宫腔内人工授精(IUI)临床效果及卵巢反应预测因子。方法:选择多囊卵巢综合征、WHO II型排卵障碍及不明原因不孕患者60例,采用rhFSH(果纳芬)低剂量递增方案促排卵联合IUI,分析妊娠率、多胎妊娠率、卵巢过度刺激综合征(OHSS)发生率,并对卵巢反应预测因子加以分析。结果:①临床妊娠率28.21%,双胎妊娠率9.09%,流产率18.18%,促排卵过程中发生OHSS(轻度)1例,无三胎及以上妊娠。②促排卵成功患者与卵巢反应不良患者在体质量、体质量指数(BMI)、窦卵泡数(AFC)、rhFSH总剂量比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:rhFSH低剂量递增方案可以使排卵障碍特别是对其他促排卵药物抵抗患者获得较好的妊娠结局,促排卵结局可能受患者体质量、BMI、AFC等因素影响。

第1批重组人促卵泡素生物测定用国家标准品的制备与标定

目的:制备并标定第1批重组人促卵泡素(recombinant human follicle-stimulating hormone,Follitropin,rh FSH)国家标准品(生物测定用)。方法:以WHO第2批重组人促卵泡素国际标准品08/282作为标准,采用《中华人民共和国药典》2015年版四部1216卵泡刺激素生物测定法,联合4个实验室参加协作标定。蛋白含量及纯度测定采用SE-HPLC法,解离亚基与聚合体测定采用SDS-PAGE电泳法,RP-HPLC法测定氧化α亚基等主要理化指标,参照国家食品药品监督管理总局颁发的生物制品标准YBS00172015进行;采用N端测序、肽图等方法对标准品制备用原液进行了结构确认,并对待标品进行稳定性考察。结果:重组人促卵泡素待标品经协作标定,最终定值其生物效价为每瓶174 IU;每瓶重组人促卵泡素含量11.5μg,纯度96.46%,测定聚合体、解离亚基、氧化α亚基等相关物质理化指标,均符合规定;稳定性考察合格,N端测序和肽图结果均符合理论要求。结论:本批待标品确认为重组人促卵泡素,可作为第1批重组人促卵泡素(rhFSH)国家标准品,以供重组人促卵泡素及相关制剂的生物效价测定用,本批标准品生物效价为每瓶174 IU。

长效卵泡刺激素研究进展

卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)是一种糖蛋白激素,是临床上治疗男女不孕症的主要药物之一,在人类辅助生殖技术中扮演着重要的角色。但是由于其半衰期相对较短,需要频繁给药,患者的依从性较差。近年来,开发半衰期长、生物活性高的长效卵泡刺激素成为新药研究的热点。目前实现卵泡刺激素长效化的方法主要为增加糖基化位点和与IgG Fc片段融合。本文就文献报道的长效卵泡刺激素药物分子和它们的主要生物学特性进行综述。

重组人促卵泡激素体内生物活性和对幼龄大鼠超排卵作用

目的：评价新生物类似药重组人促卵泡激素（recombinant human follicle-stimulating hormone,rh FSH）的体内生物活性和药效学超排卵作用,并与参照药即已上市的果纳芬（Gonal-F（R））比较其相似性。方法：生物活性测定按《中华人民共和国药典》（Ch P）雌幼龄大鼠卵巢增重法进行;药效学研究为以未成年4~5周龄,体重60~80 g的SD雌性大鼠研究rh FSH超排卵作用,实验结束后检测超排卵效果。结果：rh FSH该批冻干制剂的生物效价为85 IU/瓶,与参照药果纳芬（Gonal-F（R））相似;其超排卵作用比阴性对照组（空白组）卵巢系数、卵子数、组织病理学等指标显著增大（P〈0.01）,与果纳芬间的差异无显著性意义（P〉0.05）。结论：新生物类似药rh FSH批号20140502的制剂,具有较高生物活性和超排卵的作用,与参照药果纳芬（Gonal-F（R））活性和药效相似。

重组人卵泡刺激素的研究进展

综述了重组人卵泡刺激素(rhFSH)的制备和未来发展方向以及我国卵泡刺激素(FSH)产品的发展概况,重点介绍了rhFSH产品(果纳芬和普丽康)的制备技术特点。与传统的尿源卵泡刺激素(uFSH)相比,rhFSH具有纯度高且产品批次均一性好的优点,更重要的是rhFSH在提高安全性、减少治疗副反应等方面具有优势。FSH广泛地用于不孕不育的治疗当中,是用于生殖健康领域的重要药物分子,有着很大的市场发展前景。

重组人促卵泡激素质量控制中理化测定代替生物测定简介

本文综述重组人促卵泡激素(rhFSH)质量控制中的生物测定的作用与局限性。对长期批次间一致的rhFSH产品,理化测定将代替生物效价的测定,但在研发阶段仍需选择生物测定。

长效重组人促卵泡激素主要功效的对比研究

目的：评价并比较生物类似药候选药长效重组人促卵泡激素（rh FSH-CTP）与参照药Elonva的功能差异,即对幼龄大鼠体内主要药效学作用的相似性。方法：生物活性测定按中国药典方法进行;药效学研究以未成年4-5周龄,体重70-90 g的SD雌性大鼠研究其超排卵作用。结果：rhFSH-CTP注射液的生物效价为453 IU·支-1,与参照药Elonva体内活性相当,两者差异很小;其超排卵作用相比于阴性对照组（空白组）卵巢系数、卵子数、组织病理学总评分等指标显著增大（p〈0.05）,大鼠血清激素水平即雌二醇（E2）、黄体激素（LH）、促卵泡激素（FSH）、孕酮（P）等都有不同程度增加,尤其E2增加显著（p〈0.05）;各指标与Elonva间的差异无显著性意义（p〉0.05）。结论：生物类似药候选药rhFSH-CTP批号20140901的制剂,具有生物活性和促进卵泡发育成熟超排卵的长效作用,与参照品Elonva活性和药效相似。

基于报告基因的重组人促卵泡激素Fc融合蛋白生物学活性测定方法研究

目的:利用转基因细胞法建立重组人促卵泡激素Fc融合蛋白(rhFSH-Fc)生物学活性检测方法。方法:利用CHO-K1-FSHR-CRE-Luc转基因细胞,按一定细胞密度种板,培养16~20 h后吸弃培养基,将rhFSH-Fc倍比稀释加入细胞板,药物作用一段时间后加入荧光素酶检测试剂,通过荧光素酶检测系统对rhFSH-Fc进行生物性活性检测,并对各试验条件参数优化及进行方法学验证。结果:rhFSH-Fc在该方法中存在量效关系且符合四参数曲线方程,R;大于0.99;方法优化后确定细胞种板密度为5×10^(5)个·mL^(-1),rhFSH-Fc稀释起始浓度为750 ng·mL^(-1),1∶5倍的稀释倍数,诱导时间为4 h,样品稀释液为DMEM/F12K+10%FBS。该方法具有良好的专属性,9次独立日间、日内精密度检测RSD均小于5%,5个不同稀释组回收率样本经6次测定,相对效价分别为(51±2.00)%、(78±2.05)%、(94±2.23)%、(124±3.46)%、(141±4.45)%;对应回收率平均值分别为(101±3.94)%、(104±3.00)%、(94±2.24)%、(99±2.68)%、(94±3.03)%,RSD均小于4%。结论:本研究利用转基因细胞成功建立rhFSH-Fc生物学活性测定方法,该方法操作简便,重复性好,准确性高,可用于rhFSH-Fc产品的常规检测。

国产与进口重组人FSH在辅助生殖技术超排卵治疗中的疗效比较

目的本研究旨在比较国产与进口重组人促卵泡激素(recombinant human follicle stimulating,rhFSH)在辅助生殖技术超排卵治疗中的疗效差异。方法回顾分析了2018年1月—12月在首都医科大学附属北京妇产医院生殖科接受控制性超促排卵后行IVF-ET/ICSI治疗的192个周期的临床资料,根据所用药物不同分为国产组(A组,101个周期)和进口组(B组,91个周期),比较两组患者的一般情况、基础激素水平、用药情况、获卵情况和妊娠结局等是否存在差异。结果两组的一般情况、基础激素水平和基础卵泡数均无显著差异(P>0.05)。两组rhFSH人均用药总量、人均用药天数、加用HMG人数比例、人均用HMG总量、天数,HCG日子宫内膜厚度、LH水平均无明显差异(P>0.05);但是进口组获卵数、HCG日E2、P0水平高于国产组,差异有统计学意义(P<0.05)。两组胚胎种植率、生化妊娠率、临床妊娠率以及流产率均无明显差异(P>0.05);但是,国产组的多胎妊娠率高于进口组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论使用相同剂量的rhFSH进行超排卵治疗,国产组可获得与进口组大致相同的胚胎种植率、生化妊娠率、临床妊娠率以及流产率,在不孕患者的辅助生殖治疗中不失为一种好的选择。