分泌型重组人生长激素的研制

从人脑垂体组织中克隆了人生长激素基因并构建了分泌型表达基因工程菌Ｅ．ｃｏｌｉＫ８０２／ｐＡＶＧＨ。研制的ｒｈＧＨ中试产品。

利用Gateway技术构建黄瓜HPL基因的RNA干扰载体

为探讨黄瓜脂氢过氧化物裂解酶基因(HPL)下调表达对黄瓜果实挥发性醛类物质合成的影响,设计1对特异引物,以黄瓜pDONR201-HPL质粒为模板,通过PCR扩增出323bp的片段。利用基于同源重组原理的Gateway技术,将扩增的片段通过BP反应连接到入门载体pDONR201中。对扩增出的323bp的片段进行测序,测序结果显示该序列与原序列同源性为100%。在此基础上,通过LR反应将目的片段插入过表达的植物RNA干涉载体pHellsgate8,构建黄瓜HPL基因的RNAi表达载体pHellsgate8-HPLi,分别经限制性内切酶XhoⅠ、XbaⅠ酶切后获得323bp的片段,与预期结果一致。采用热击法将pHellsgate8-HPLi转化农杆菌GV3101,经菌液PCR扩增获得323bp的目的条带,表明RNAi表达载体pHellsgate8-HPLi已成功转入农杆菌中。

以木糖异构酶基因xylA为选择标记的Gateway系统植物表达载体的构建

目的:构建以木糖异构酶基因xylA为筛选标记的无抗生素标记Gateway系统植物表达载体。方法:克隆大肠杆菌木糖异构酶基因xylA并用其替换植物表达载体pCAMBIA1301中的hpt基因,利用载体中的多克隆位点将Gateway Binary Vector(pH7WG2D)中酶切位点XbaⅠ和HindⅢ之间包括P35S、T35S、attR1、attR2和CmR-ccdB的片段重组入表达载体pCAMBIA1301中,构建表达载体pCAMBIA1301-xylA-GW,利用含有津田芜菁HY5基因片段的BP反应产物与载体进行LR反应,获得含有目的基因的植物表达载体pCAMBIA1301-xylA-HY5,并导入根癌农杆菌LBA4404中。结果:抗生素筛选及酶切和PCR鉴定表明成功构建了以xylA为筛选标记的无抗生素标记植物表达载体pCAMBIA1301-xylA-HY5。结论:利用木糖异构酶基因xylA结合Gateway克隆技术构建无抗生素标记植物表达载体,可简化、方便植物转基因表达载体构建。

拟南芥蛋白磷酸酶基因AtPP2C的克隆及植物表达载体的构建

根据GenBank中已发表的拟南芥蛋白磷酸酶基因AtPP2C(AT1g07430)的cDNA序列设计并合成了1对引物。通过RT-PCR方法从NaCl处理的拟南芥总RNA中扩增出AtPP2C基因的全长cDNA片段,采用gateway技术中的BP反应将其克隆到pDONR201中。测序表明,该片段与GenBank上报道的序列具有100%的同源性。采用gateway技术中的LR反应,以植物表达载体pLEELA为基础,构建了由组成型启动子35S调控的AtPP2C基因的植物表达载体pLAT35S。

β-甘露聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质

以能水解魔芋葡甘聚糖的野生筛选菌种枯草杆菌A 33为材料,通过PCR技术从A 33基因组中扩增出β-甘露聚糖酶基因编码序列.经过克隆、测序及BLA ST比对分析,证实该基因编码β-甘露聚糖酶,属于β-甘露聚糖酶家族中的一员,该基因已注册G enBank.将该基因克隆到原核表达载体pRSET-A中并转入大肠杆菌表达系统BL 21(DE 3)pLysS,经过诱导获得了此酶的高效表达.其表达量达到37.78 U/mL,酶学特性分析表明其作用的最适pH为5.0,最适温度为60℃.

反义DNA甲基化酶3b基因片断真核表达载体的构建及鉴定

目的构建反义DNA甲基化酶3b(DNM T 3b)基因片断真核表达载体,为研究DNM T 3b基因功能提供工具。方法根据DNM T 3b基因cDNA序列中编码序列设计PCR引物,在上下游引物5′端分别添加X baⅠ和K pnⅠ酶切位点,RT-PCR从胆管癌细胞QBC-939中获得485bp的DNA片断;将该片断反向插入真核表达载体pcDNA 3.1(+)的多克隆位点,构建反义DNM T 3b基因片断真核表达载体,并用PCR、酶切法和DNA测序鉴定。结果PCR鉴定得到467bp特异条带,双酶切鉴定得到471bp片断和5.4kb载体片断,DNA测序说明插入片断序列正确。结论本研究构建的反义DNM T 3b基因片断真核表达载体可为进一步研究DNM T 3b基因功能提供实验工具。

美洲黑杨木质素合成关键基因的克隆及反义表达载体的构建

以美洲黑杨Populus deltoides新萌叶片为材料,通过自行设计引物,用RT—PCR的方法克隆了美洲黑杨木质素合成关键基因4CL和CAD基因部分序列。测序结果表明:这两个基因片段长度分别为859 bp和493 bp。此外,人工合成了4CL基因木质部特异表达启动子4CLp,长度为1 180 bp。分别用限制性内切酶Hind III/BamH I、BamHI/Sma I和Sma I/Sac I对4CLp、4CL和CAD基因序列进行双酶切,同时用Hind III/Sac I对pBI121表达载体进行双酶切,回收了目的片段。酶切回收后用T4DNA连接酶克隆到植物表达载体pBI121中,并转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α。经质粒PCR和双酶切分析,确定获得了pBI—4CLp—a4CL—aCAD反义植物表达载体。

基于Gateway技术的拟南芥雄性不育GHF基因表达载体的构建生物技术科学

随着模式植物拟南芥全基因组测序工作的完成更多雄性不育相关基因功能需要阐明。利用拟南芥突变体库,从反向遗传学角度进行突变基因的功能研究需要构建相应的载体进行互补实验。Gateway技术是一种高效,快速的克隆系统。笔者利用Gateway克隆技术成功构建拟南芥GHF基因表达载体,并遗传转化拟南芥,为进一步阐明该基因功能奠定了基础。

香水柠檬RHF2A的克隆与互作蛋白的筛选

【目的】以香水柠檬(Citrus limon (L.) Burm. F.)为研究对象,分析两个RHF2A的时空表达规律,利用酵母双杂交技术和双分子荧光互补试验(BiFC)筛选、验证其互作蛋白,为深入研究RHF2A在香水柠檬自交不亲和过程中的分子作用机制奠定基础。【方法】从前期转录组和泛素修饰组(未公开)筛选获得2个E3泛素连接酶RHF2A(RING-H2 Zinc Finger2A)基因RHF2A-1、RHF2A-2,并克隆其全长序列,通过生物信息学分析2个RHF2A的序列和蛋白质结构,预测其启动子顺式作用元件,构建35S-RHF2A-GFP融合蛋白表达载体用于亚细胞定位分析,采用实时荧光定量PCR分析两个RHF2A的时空表达模式,构建酵母双杂诱饵载体从香水柠檬酵母文库筛选互作蛋白。构建BiFC载体,在洋葱活体细胞内对目标蛋白进行互作验证。【结果】从香水柠檬克隆获得RHF2A-1、RHF2A-2,ORF全长分别为1 161和1 134 bp;NCBI结构域预测发现其具有Ring/U-box结构域。启动子分析发现其具有花粉特异性表达相关元件POLLEN1LELAT52、GTGANTG10。组织表达分析发现RHF2A-1在花粉特异性表达,RHF2A-2在叶中特异性表达;时空表达分析结果显示,RHF2A-1在自交柱头表达量从第1天开始升高,第3天达到峰值,是杂交柱头表达量的5倍以上。亚细胞定位显示RHF2A-1和RHF2A-2定位在细胞核。经过Uniprot网站预测其互作蛋白显示RHF2A能与KRP6、AT3G57370、UBA1、FBL17、SK11蛋白相互作用,推测其参与自交不亲和泛素化反应途径、配子体发育调控、花粉的生长发育等生物学过程。通过酵母双杂交技术筛选出72个克隆,对其测序并进行Blast比对后排除重复克隆,最终得到ABCF3等20个候选互作蛋白。经过一对一互作验证、双分子荧光互补实验确定RHF2A-1与ABCF3-2存在互作关系。【结论】RHF2A-1的时空表达规律与自交不亲和过程中花粉在雌蕊上的萌发规律相吻合;筛选得到柠檬授粉过程中直接影响花粉生长发育的互作候选蛋白,初步证明RHF2A-1在自交不亲和过程中具有重要作用。

胶体金标记技术检测麻疹抗体方法的建立

目的利用原核基因表达的麻疹H蛋白,结合胶体金微粒,制备检测麻疹IgG抗体的胶体金层析试纸条。方法利用抗IgG抗体结合IgG抗体-麻疹H蛋白-金微粒的原理,优化条件,确定最佳标记蛋白pH值及蛋白量等,制备胶体金试纸条,并进行样本检测。结果根据自身表达蛋白的特点及浓度,标记的金微粒pH值为9.0,蛋白量为24μg/ml。79份样品中,阳性符合率为94.2%,阳性检出率组间比较差异无统计学意义。结论该试纸条测定麻疹IgG抗体表现了良好的符合率,可以考虑用于条件比较差的县区麻疹IgG的监测,简便快速,有良好的经济效益。

利用 TA 克隆的方法简便构建入门克隆

Gateway 技术是一种通用型克隆方法,其基于λ噬菌体位点特异性重组,将目的 DNA 快速克隆到各种与 Gateway 技术兼容的目的载体上,不需要进行酶切和连接反应。但存在获得入门克隆过程中相关反应酶制剂价格昂贵,且药品订购时间较长等问题。通过对入门载体 pDONR207 的改造,使之产生 3’端具有单个 T-末端的线性化的入门载体,采用 TA 克隆的方法替代 BP 反应,从而简便、经济和快速地获得入门克隆。利用改造后的 Gateway 技术构建拟南芥 SOS2 基因的原核表达载体和真核表达载体,通过原核表达和原生质体瞬时表达证明通过此方法构建的表达载体在原核细胞和真核细胞中都得到了很好的表达。