rhIFN-γ对小儿瘢痕中离体成纤维细胞的影响

目的:观察rhIFN-γ对离体小儿瘢痕成纤维细胞生物学作用的影响。方法:分离、培养小儿挛缩瘢痕组织中的成纤维细胞,加入不同浓度rhIFN-γ进行刺激,采用MTT法检测细胞增殖,流式细胞术分析细胞周期,分光光度计测定胶原含量,透明座标纸测定成纤维细胞胶原网架(FPCL)的直径并计算收缩指数。结果:rhIFN-γ达到一定浓度后,成纤维细胞的增殖活性明显下降(P<0.01);细胞分裂受抑制,G1期细胞所占比例增高(P<0.01);胶原合成减少,FPCL收缩指数下调(P<0.01)。结论:rhIFN-γ是成纤维细胞的负性调节因子,能抑制成纤维细胞的增殖分化,下调胶原纤维含量及成纤维细胞胶原网的收缩性,起到抑制瘢痕增生的作用。

rhIFN-γ联合维生素E对慢性乙型肝炎纤维化影响研究

目的探讨重组人干扰素-γ(rhIFN-γ)联合维生素E对慢性乙型肝炎肝纤维化的影响。方法将50例慢性乙型肝炎患者随机分为对照组和治疗组,对照组仅给予保肝药,治疗组在对照组基础上加用rhIFN-γ及维生素E,疗程6个月。比较两组治疗前后ALT、AST及血清前胶原Ⅲ(PⅢP)、胶原Ⅳ(Ⅳ-C)、层连蛋白(LN)、透明质酸酶(HA)水平及治疗前后肝脏病理炎症积分,分析疗程结束时两组肝纤维化变化情况。结果两组ALT、AST均较治疗前有明显好转(P<0·05)。治疗组PⅢP、Ⅳ-C、HA、水平较治疗前显著降低(P<0·05),LN无明显的变化;对照组PIIIP、Ⅳ-C、HA、LN水平与治疗前相比,无显著的统计学意义。治疗组炎症、纤维化积分较治疗前有明显的下降(P<0·05),对照组无显著性改变。治疗后治疗组各期病理逆转率及总逆转率均优于对照组(P<0·05)。结论重组人干扰素γ联合维生素E对肝纤维化的发展具有一定的阻断作用,此疗法具有较好疗效、无明显副反应。

重组人干扰素-β(rhIFN-β)中试工艺研究

目的 建立适合大规模生产重组人干扰素 β(rhIFN β)的分离纯化工艺。 方法 采用超声破菌、离心分离包涵体、仲丁醇萃取、Sephacryl 10 0、HIC层析等分离纯化步骤。结果 纯化的rhIFN β纯度达 98%以上 ,比活性为 2 .0× 10 7IU/mg,各项质量指标均符合质控标准。结论 此纯化工艺简便 ,可重复性好 ,适于大规模生产。

rhIFN-α对病理性瘢痕成纤维细胞影响的实验研究

目的:研究rhIFN-α对病理性瘢痕成纤维细胞生物学行为的影响,探讨细胞因子对病理性瘢痕的作用机制。方法:对病理性瘢痕成纤维细胞进行体外培养,采用倒置显微镜、MTT法、流式细胞术等方法进行观察、分析,研究rhIFN-α对病理性瘢痕成纤维细胞体外生长、增殖、细胞周期、Fas、Bcl-2表达的影响,数据用方差分析和q检验处理。结果:加入rhIFN-α后,细胞表现为生长趋势及增殖活性被明显抑制,S-G2-M期细胞百分数明显降低,Fas、Bcl-2蛋白表达量分别显示升高和降低。结论:rhIFN-α对成纤维细胞的生长趋势及增殖活性有明显抑制作用,可促进成纤维细胞凋亡。提示rhIFN-α是成纤维细胞负性调节因子,在病理性瘢痕的治疗中有一定的应用价值。

应用pET系统表达rhIFN-α2b基因的研究

目的 以构建的pET28a为表达载体,探讨人 IFN-α2b基因在pET系统中的表达。方法 合成引物,通过PCR扩增人 IFN-α2b基因并引入点突变,在不改变天然 IFN-α2b氨基酸序列的前提下,使原 IFN-α2b基因4个大肠杆菌稀有密码子改变为偏爱密码子,在起始密码子后,编码前16个氨基酸的碱基序列均成为大肠杆菌的偏爱密码子。将PCR产物次级克隆人pET28a载体,构建重组表达载pET28a-IFN-α2b。筛选正确的重组表达质粒pET28a-IFN-α2b转入感受态表达菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,粗提并检测 IFN-α2b活性。结果 重组质粒pET28a-IFN-α2b在宿主菌 BL21(DE3)中表达出的rhIFN-α2b以可溶性蛋白形式存在于粗提上清液中,与原来 pBV889系统表达的干扰素相比,具有更高的生物学活性。结论 应用pET表达系统可表达出具有更高生物学活性的rhIFN-α2b蛋白。

YPEG-rhIFN-α_(2a)修饰位点结构解析

目的对Y型PEG化重组人干扰素α_(2a)的PEG修饰位点进行了相关研究。方法首先采用HPLC SP方法对YPEG-rhIFN-α_(2a)的不同修饰位点组分进行分离;然后用TPCK胰酶酶切rhIFN-α_(2a)和YPEG-rhIFN-α_(2a),通过HPLC-RPC法分离酶切肽段,进而用质谱法(MALDI-TOF MS)解析rhIFN-α_(2a)肽段,获得rhIFN-α_(2a)完整的TPCK胰酶肽图信息;最后对比分析rhIFN-α_(2a)和YPEG-rhIFN-α_(2a)的HPLC-RPC TPCK胰酶肽图,结合N-端氨基酸序列测定法测定PEG肽段的氨基酸序列,确认YPEG-rhIFN-α_(2a)的PEG修饰位点。结果及结论结果表明,YPEG-rhIFN-α_(2a)的PEG修饰位点主要为Lys134和Lys31。

干扰素对腭裂术后裸露骨面瘢痕成纤维细胞生物学影响的实验研究

目的：探讨干扰素（IFN）对体外培养的腭裂术后裸露骨面瘢痕来源的成纤维细胞生物学作用的影响。方法：制作兔腭裂术后裸露骨面瘢痕动物模型,利用体外细胞培养技术,通过MTT法、流式细胞术等方法观察、分析rhIFNα-2b和rhIFN-γ对腭裂术后瘢痕成纤维细胞生物学行为的影响,数据采用方差分析及q检验处理。结果：与对照组比较,实验组加入干扰素后,腭裂术后瘢痕成纤维细胞的生长趋势及增殖活性及被明显抑制,S-G2-M期细胞百分数明显降低。结论：干扰素对腭裂术后瘢痕成纤维细胞的生长趋势及增殖活性具有明显抑制作用,说明在防治腭裂术后裸露骨面瘢痕的形成中有一定的应用价值。

异甘草酸镁对人表皮角质形成细胞炎症因子的产生和外周血白细胞趋化功能的影响

目的:研究异甘草酸镁对角质形成细胞产生促炎症细胞因子、黏附分子和对白细胞趋化功能的影响,以获得异甘草酸镁治疗炎症性皮肤病的药理学基础。方法:采用2 000 U/mL rhIFN-γ诱导人表皮角质形成细胞HaCaT细胞,用ELISA法检测不同浓度的异甘草酸镁对HaCaT细胞IL-8、IL-6和ICAM-1产生的影响;通过琼脂糖平板法在显微镜下观察药物对10 nmol/L甲酰甲二磺酰-亮氨酰-苯丙氨酸(fMLP)诱引的人白细胞移动距离的影响。结果:异甘草酸镁能剂量依赖性地抑制rhIFN-γ刺激引起的IL-8、IL-6和ICAM-1的产生,其IC50值分别为1.21、7.23和4.17μg/mL;对fMLP诱引的人外周血白细胞趋化功能有明显影响,其抑制作用呈剂量依赖性,IC50值为8.58μg/mL。结论:异甘草酸镁可通过抑制人表皮角质形成细胞IL-8、IL-6、ICAM-1产生和白细胞趋化达到治疗炎症相关性皮肤病的作用。

A23187诱导HL-60细胞分化为树突状细胞的研究

目的探讨用钙离子载体A23187通过钙动员机制使人急性粒细胞性白血病细胞系HL-60细胞迅速分化为树突状细胞（DCs）的方法，为今后临床用DCs进行抗白血病免疫治疗打下基础。方法将生长良好的HL-60细胞加入不同浓度A23187（45～720ng／mL）或联用重组人γ-干扰素（rhIFN-γ，1000U／mL）培养20～96h，倒置显微镜和扫描电镜观察其形态学特征，流式细胞术检测其免疫表型，混合淋巴细胞反应检测其刺激T淋巴细胞增殖的能力。结果HL-60细胞加入适量A23187（180ng／mL）或联合rhIFN-γ（1000 U／mL）诱导20h后，即可出现细胞表面树状突起，且树突状细胞表面特异性成熟标志抗原CD83、共刺激分子CD80、CD86表达升高；培养48h，CD83分子表达开始降低；培养72h，可获得DC的典型形态，CD80、CD86分子表达持续升高。同种异体混合淋巴细胞反应检测经A23187或联用rhIFN-γ诱生的DCs可明显刺激同种异体T淋巴细胞增殖。结论钙离子载体可诱导HL-60细胞分化为高表达共刺激分子及具有刺激同种异体T淋巴细胞增殖的成熟DCs，钙动员有望成为一种快速获取DCs的有效方法。

重组人干扰素-α2a(IFN-α2a)的圆二色谱分析

目的:研究测量温度和蛋白质浓度对重组人干扰素-α 2a(rhIFN-α 2a)圆二色谱的影响,进而研究对 rhIFN-α 2a 二级结构比例的影响。方法:分别研究了测量温度和蛋白质浓度对 rhIFN-α 2a 圆二色谱的影响,另外还对不同厂家、不同批次的4批 rhIFN-α 2a 的圆二色谱进行了比较。结果:测量温度在60～95℃之间,rhIFN-α 2a 圆二色谱的形状发生改变,三级结构遭到破坏,二级结构发生改变;在5～60℃温度区间,二级结构相对稳定。rhIFN-α2a 的各二级结构比例在1.5～0.006nag·mL^(-1)范围内相对稳定。不同厂家、不同批次的4批 rhIFN-α 2a 的圆二色谱形状基本一致,4种二级结构的比例相近。结论:在一定的温度和浓度范围内,rhIFN-α 2a 的圆二色谱相对稳定,且不同批次的测量结果具有很好的一致性。圆二色谱可用于蛋白质类药物的质量控制。

复发性外阴阴道假丝酵母菌病免疫发病机制及治疗效果研究

目的通过咪康唑栓局部治疗基础上加用rhIFN-γ(重组人干扰素γ)治疗复发性外阴阴道假丝酵母菌病(RV-VC)效果评价,研究免疫调节机制在本病中地位和作用。方法120例RVVC病人,随机分成治疗组60例用咪康唑栓400mg,阴道用药,1次/日,共6天为一疗程,同时加用rhIFN-γ100万U肌内注射,2次/周;对照组60例。单纯采用咪康唑栓局部治疗,疗程4周。结果治疗组痊愈率68.33%(41/60)显著高于对照组35.0%(21/60),显效率对照组56.67%(34/60)高于治疗组26.67%(16/60),治疗组血清IL-18(治疗前111.71±18.45,治疗后189.18±28.17)和TNF-α水平(治疗前52.66±18.75,治疗后124.25±43.77)显著升高(P<0.01),对照组血清IL-18、TNF-α水平无显著差异(P>0.05)。结论RVVC在局部治疗基础上加用rhIFN-γ治疗,能通过调整免疫功能,主要是诱导IL-18和TNF-α产生,将显著改善病人痊愈率。说明通过改善患者的细胞免疫功能,将对RVVC治疗产生较好的疗效。

重组人干扰素-γ的制备与鉴定

用聚乙二醇200疏水相互作用色谱固定相(PEG200-STHIC)分别在色谱柱和色谱饼上完成了一步复性并同时纯化来源于大肠杆菌(E.coli)表达的重组人干扰素-γ(rhIFN-γ)。为了能使色谱分离方法用于不同来源的rhIFN-γ的纯化,对rhIFN-γ在反相色谱、离子交换色谱、固定化镍离子亲和色谱上的保留行为也进行了研究。色谱柱纯化的rhIFN-γ收集液经排阻色谱除盐和冷冻干燥得到rhIFN-γ干粉。用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对rhIFN-γ干粉进行了测定,rhIFN-γ单体的相对分子质量为17184.0,二聚体的相对分子质量为34204.4。用细胞病变抑制法(CPEI)测定rhIFN-γ干粉的比活性为9.5×108IU/mg。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定rhIFN-γ干粉的纯度高于95%。用色谱柱复性并同时纯化rhIFN-γ的质量回收率达到93.7%,纯度高于95%,比活性为4.3×107IU/mg。结果表明,采用PEG200-STHIC色谱柱复性并同时纯化rhIFN-γ是一种十分高效的方法。

重组人干扰素-γ与参考品圆二色谱图对比分析

目的:通过对重组人干扰素-γ(rhIFN-γ)供试品与rhIFN-γ参考品和重组人干扰素-α2a(rhIFN-α2a)参考品圆二色谱图形比较,进而验证他们的结构是否一致。方法:分别独立处理rhIFN-γ供试品和rhIFN-γ参考品3次,每次分别在190～240nm波段(远紫外区)和250～320nm波段(近紫外区)用圆二色谱测量,对得到的6组远紫外区数据和6组近紫外区数据,分波段进行相关性分析,然后对相关系数做统计分析;再用同样方法,对rhIFN-γ供试品和rhIFN-α2a参考品圆二色谱图形对比分析。结果:rhIFN-γ供试品和rhIFN-γ参考品在远紫外区和近紫外区圆二色谱图形没有差别;但rhIFN-γ供试品和rhIFN-α2a参考品在2个波段圆二色谱图形都有明显差别。结论:在远紫外区rhIFN-γ供试品和rhIFN-γ参考品圆二色谱图形的一致,说明两者二级结构比例相同,在近紫外区圆二色谱图形的一致,说明两者侧链生色团的排布相同,从而说明两者结构相同;而rhIFN-γ供试品和rhIFN-α2a参考品在远紫外区和近紫外区两者圆二色图形均不一致,说明二者在结构上不同。

蛋白折叠液相色谱法中流动相对重组人干扰素-γ质量回收率的影响

蛋白折叠液相色谱法(PFLC)用于变性蛋白质复性并同时纯化时对流动相组成及其洗脱条件的要求远较通常的液相色谱法高。用端基为PEG-200的高效疏水作用色谱固定相对重组人干扰素-γ(rhIFN-γ)进行纯化并同时复性,详细研究了流动相组成、梯度洗脱模式和流速对rhIFN-γ质量回收率和活性的影响。分别以3.0mol/L(NH4)2SO4+0.05mol/L KH2PO4(pH7.0)和0.05mol/L KH2PO4(pH7.0)为流动相A和B,采用35min非线性梯度洗脱时,所得rhIFN-γ的质量回收率最高。

甲醇酵母分泌表达重组人干扰素α1b纯化工艺的建立

建立适合大规模、低成本生产重组人干扰素α1b(Recombinanthumaninterferon α1b ,rhIFN α1b)的纯化工艺。采用高效分泌表达rhIFN α1b的甲醇酵母工程菌发酵 ,收集离心后的上清液 ,超滤脱盐 ,经离子交换柱和分子筛柱层析纯化。纯化的rhIFN α1b的纯度为 98%以上 ,比活性 2 .4× 10 7IU/mg ,活性回收率 14 % ,相对分子质量 1980 0和等电点 5 .0。经检测 ,rhIFN α1b蛋白N 端 15个氨基酸序列与正常对照完全符合。该纯化工艺简便 ,时程短 ,重复性好 。

干扰素作用下乙型肝炎病毒的变异机制

目的:体外研究干扰素-α2b(IFN-α2b)作用下乙肝病毒(HBV)突变机制. 方法:以不同浓度IFN-α2b反复作用于HBV分泌型HepG2.2.15细胞,Western blot方法检测培养细胞上清中AFP,提取培养细胞上清中HBV基因组DNA,以聚合酶联反应扩增HBV C基因,克隆入pGEM-T easy 载体,鉴定后行测序分析. 结果:Western blot方法检测各组培养细胞上清中AFP, 实验组AFP未见明显减少;序列分析表明,对照组前C/ C基因克隆有两种类型,同源性93%,有10个氨基酸的差别,其中6个氨基酸相比,氨基酸的性质相同; 实验组同样具有这两种克隆,其中优势株所占比例分别为12/15、14/14和9/15,高剂量组与对照组相比优势株所占比例差异有统计学意义(P<0.05);实验组高剂量IFN 组出现了四个插入/缺失突变克隆,造成前C/C基因移框突变,其中C31-2插入突变发生在前C区,另外3个突变均发生在C区,与优势株相比平均同源性97%以上. 结论:在rhIFN-α高剂量条件选择下,能检测到HepG2. 2.15HBV前C/C基因插入或缺失突变株,突变株与优势株相比基因序列同源性平均在97%以上.

用地高辛标记探针检测基因工程人β干扰素制品中的外源DNA

基因工程人β干扰素工程菌经发酵培养、纯化后获得纯的制品，采用斑点杂交技术，用非放射性地高辛标记超声裂解的全工程菌ＤＮＡ作为探针，检测基因工程人β干扰素纯品，结果显示：基因工程人β干扰素纯品中的外源ＤＮＡ含量小于１００ｐｇ／剂。

重组人IFN-γ对抗原SC3A表达的上调作用

目的 :探讨重组人IFN -γ(rhIFN -γ)在体外对SW1116抗原SC3A表达的影响。方法 :将rhIFN -γ与SW1116在37℃共育24、48和72h后 ,分别用免疫细胞化学染色法和流式细胞仪测定其SC3A抗原 (SC3AAg)的表达。结果:SW1116与20u/mlrhIFN -γ共育24、48和72h ,其SC3AAg 阳性细胞分别为95.5 %、93.2 %和95.2 %,PBS组分别为11.3 %、12.2 %和10.0 % ,AGZY -83 -a细胞系均未见SC3AAg 阳性细胞 ,阳性对照组的C1184细胞系SC3AAg阳性细胞80.5 %。结论 :2u/mlrhIFN -γ能使SW1116细胞的SC3AAg表达明显上调 ,其中20u/ml、24h是表达峰值的最佳浓度和时间。

慢性肾功衰竭患者免疫功能紊乱的效应体CD23分子的表达与调控

目的：研究慢性肾功能衰竭（ＣＲＦ）患者免疫功能紊乱的效应体ＣＤ２３分子的表达与调控。方法：利用细胞培养和间接免疫荧光技术，比较了ＣＲＦ患者与正常人外周血Ｂ细胞膜ＣＤ２３的表达，并研究重组人白介素４（ｒｈＩｌ－４）和重组人γ干扰素（ｒＨＩＦＮ－γ）对ＣＤ２３的调控作用。结果：ＣＲＦ患者外周血ＣＤ２３＋Ｂ细胞较正常人显著增高；ＩＬ－４能促进ＣＲＦ患者和正常人Ｂ细胞ＣＤ２３的表达；ＩＦＮ－γ可显著抑制ＩＬ－４诱导的Ｂ细胞ＣＤ２３的表达。结论：ＣＲＦ患者存在Ｂ细胞的激活；ＣＲＦ患者和正常人一样，外周血Ｂ细胞ＣＤ２３表达受ＩＬ－４上调和ＩＦＮ－γ下调影响；ＣＤ２３分子不仅是ＣＲＦ患者免疫功能紊乱的效应体，而且可能参与这些患者免疫紊乱的发病机理。