rhIL-13在毕氏酵母中的表达及生物学活性研究

目的 在甲醇营养型毕氏酵母蛋白质表达系统中高效表达重组人白介素 - 13(rhIL - 13) ,便于进一步研究开发。方法 根据酵母对密码子的偏爱性设计并人工合成了人IL - 13编码基因片段 ,经T4DNA连接酶、PCR技术连接形成IL - 13cDNA全长序列 ;将其插入 pPICZαA质粒中 ,构建成 pPICZαA -IL - 13表达载体 ;该载体经SacI线形化后以电转化法导入GS115酵母菌株中 ,经YPD平板Zeocine抗性筛选获得IL - 13表达阳性菌株 ;用WesternBlotting和ELISA检测发酵上清中IL - 13的抗原性和表达量 ,B9-11细胞株分析其生物学活性。结果 15 %SDS -PAGE显示重组人IL - 13分子量约 13kd ,Western -blotting证实为人IL - 13,ELISA测定在摇瓶培养上清表达量达 15 μg/ml,其生物学活性同标准品一样具有剂量依赖性的刺激B9-11细胞株增殖的作用。结论 成功获得IL - 13人工基因和稳定分泌蛋白的基因工程菌株 ,该重组蛋白的生物学活性达到标准品的要求。

原癌基因c-fos及c-myc在IL-13诱导Dami细胞分化中的表达关系

目的研究重组人白细胞介素-13(recombinant humaninterleukine-13,rhIL-13)诱导Dami细胞分化中原癌基因c-fos及c-myc表达,探索原癌基因c-fos及c-myc在IL-13信号传导通路中的作用。方法采用RT-PCR检测rhIL-13分别作用不同时间GPⅡb mRNA、c-fos mRNA和c-myc mRNA的表达;Western Blotting检测c-Fos和c-Myc的表达。结果IL-13促进巨核细胞表面标志物GPⅡb mRNA表达;诱导原癌基因c-fos mRNA和蛋白的表达,并随后下调原癌基因c-myc mRNA和蛋白的表达。结论原癌基因c-fos与c-myc参与了IL-13诱导的信号传导并具有相关性。

重组人白细胞介素-13在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定

采用大肠杆菌(Escherichia coli)作为宿主,通过300L发酵罐进行中试发酵表达重组人白细胞介素-13(rhIL-13)融合蛋白;经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导,离心发酵液收集菌体,菌体经溶解、变性、稀释复性及亲和层析捕获,获得融合蛋白;融合蛋白经肠激酶酶切后,再经亲和层析分离和分子筛精细纯化等步骤,获得高纯度rhIL-13原液.每升发酵液可获得高纯度的rhIL-13原液约30mg.通过本纯化工艺获得的rhIL-13原液经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法检测,纯度大于98.75%;经高效液相色谱分子排阻(HPLC-SEC)法检测,纯度为100%;质谱(MS)法测定rhIL-13分子质量为12 348u,与理论值基本一致;采用噻唑蓝(MTT)法进行比活性检测,比活大于8.0×106 IU/mg;采用HPLC-SEC法和MS法对rhIL-13二硫键数目和位置进行分析,结果显示二硫键数目和位置与理论一致.此操作方法可获得高纯度、高活性的rhIL-13原液,并且操作简单,易于放大,可实现工业化规模生产.

重组人白细胞介素13的二硫键解析

目的解析重组人白细胞介素13的二硫键连接方式。方法本研究根据氨基酸序列的特点,设计了胰酶(Trypsin)和胰凝乳蛋白酶(α-Chymotrypsin)的复合的酶切方式,液相分离结合MALDI质谱鉴定分析了重组人白细胞介素13的二硫键定位。结果实验样品中的主要二硫键连接方式为Cys28/Cys56,Cys44/Cys70,与文献报道的白细胞介素13的理论连接方式一致。结论本研究为白细胞介素13的二硫键连接方式的质量控制提供了有效的方法,也为其它多肽/蛋白的二硫键定位研究提供思路。

重组人白细胞介素-13对巨核细胞系-Dami细胞原癌基因c-mpl表达的影响

目的 :研究重组人白细胞介素 13 (rhIL 13 )对巨核细胞系 -Dami细胞原癌基因c mpl表达的影响。方法 :实验组细胞培养系统中分别加入 2 5ng/ml,5 0ng/ml,10 0ng/mlrhIL 13 ,对照组不加任何细胞因子。用RT PCR法检测c mplmRNA的表达。结果 :经 2 5ng/ml、5 0ng/ml、10 0ng/mlrhIL 13处理过的实验组Dami细胞较之对照组其c mplmRNA的表达分别提高 2 4 .8%、2 7.9%和 3 1.5 %。结论 :rhIL 13增强了Dami细胞原癌基因c mpl表达 ;rhIL 13促进Dami细胞增殖的部分机制可能是通过上调c mpl的表达来实现的。

IL-13和CD86对9HTE细胞株和哮喘患儿PBMC表达CD86水平的影响

目的 了解IL -13和CD86在哮喘发病中的作用及anti CD86McAb治疗哮喘的机理。方法 随机选择门诊哮喘急性发作期患儿30例,正常健康儿童30例作为健康对照组。分别用rhIL -13、TNF- α和rhIL- 13+TNF -α干预9HTE人气道上皮细胞株和哮喘患儿外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC) ,用直接免疫荧光流式细胞术(FCM)检测9HTE人气道上皮细胞株表达CD86的百分率、PBMC中CD14 + 细胞表达CD86的平均荧光强度(MFI)及脂多糖(LPS)刺激后PBMC中CD19+ CD86 + 双阳性细胞百分率。结果 (1)分别用TNF- α、rhIL- 13和TNF- α+rhIL -13干预9HTE细胞株后CD86的表达,三组之间表达的百分率差异无统计学意义;rhIL- 13+anti- CD86McAb干预9HTE细胞株后,9HTE细胞表达CD86水平较其他组降低,差异有统计学意义。(2 )哮喘组中的空白组、IL- 13组、TNF -α组、TNF- α+IL -13组及anti CD86组的CD14 + CD86 + 的平均荧光强度和CD19+ CD86 + 百分率均较相应的对照组高,差异有统计学意义。(3)TNF -α+IL -13干预后,CD14 + CD86 + 的平均荧光强度和CD19+ CD86 + 百分率较对应的空白组、IL -13组和TNF -α组明显增高,差异有统计学意义;(4)anti CD86McAb干预后,CD14 + CD86 + 的平均荧光强度和CD19+ CD86 + 百分率较对应?

野生型和突变型人白介素13的大肠杆菌表达及活性分析

利用大肠杆菌表达野生型和突变型重组人白介素13(IL-13),以获得具有生物学活性的重组蛋白。采用PCR方法从质粒pET22b-hIL-13上扩增人成熟IL-13的编码序列。用定点突变引物扩增IL-13突变体(IL-13m)编码基因。将IL-13和IL-13m编码基因分别克隆到原核表达载体pET28a(+)中,构建质粒pET28a(+)-IL-13和pET28a(+)-IL-13m,然后将质粒转化到E.coli BL21(DE3)中,构建重组体,IPTG诱导重组蛋白表达。重组蛋白采用镍柱(Ni-NTA)纯化,纯化后复性,并分析其生物学活性。结果成功得到IL-13和IL-13m重组蛋白,经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约14.6 kD的位置出现明显蛋白条带,经Western blot证实为重组hIL-13蛋白;重组蛋白主要以包涵体形式存在。纯化复性后,重组蛋白具有生物学活性。最后成功获得了具有生物学活性的野生型和突变型重组人IL-13,为后续研究奠定了基础。