rhIL-1Ra对恒河猴肾脏毒性的病理组织学观察

目的观察重组人白介素-1受体拮抗剂(rhIL-1Ra)的毒性靶器官及毒性的严重程度。方法32只成年恒河猴分为rhIL-1Ra 2mg/(kg·d)(n=6)、10mg/(kg·d)(n=6)和50mg/(kg·d)(n=6)连续给药90天组,10mg/(kg·d)(n=4)连续给药30天组,正常对照组(n=5)和溶剂对照组(n=5)。rhIL-1Ra为皮下注射给药,每日1次。观察指标包括一般药物反应、尿八项、心电图、眼底检查、外周血细胞计数及白细胞分类、凝血时间、血清生化、外周血T细胞亚群和猴抗rhIL-1Ra抗体测定、脏器重量和脏器系数、常规病理组织学检查。结果给药后30天各给药组动物血清非特异性抗体明显升高。rhIL-1Ra 2mg/(kg·d)组其他检测指标均未见明显地改变。rhIL-1Ra 10mg/(kg·d)组给药后90天肾小球毛细血管基底膜明显增厚,但此剂量给药时间为30天时未见任何异常。rhIL-1Ra 50mg/(kg·d)组肾小球及肾小管中蛋白性液体量多,小球毛细血管基底膜增厚更为严重,且停药30天后基底膜增厚程度仍未见明显减轻或改善。结论rhIL-1Ra的主要毒性靶器官为肾脏。2mg/(kg·d)为安全剂量,10mg/(kg·d)给药30天时为安全剂量,给药90天为恒河猴中毒性剂量,而50mg/(kg·d)为明显的毒性反应剂量,可产生难以恢复的肾脏纤维化。

重组人白介素1受体拮抗剂(rhIL-1Ra)重复给药导致大鼠和食蟹猴产生结合抗体

限制大分子药物使用的关键因素之一为诱导抗体产生。新药安全性评价时往往不得不采用多种动物评价人源蛋白的安全性,因此,测定动物产生抗体水平是正确评价大分子药物的前提。为了检验重组人白介素1受体拮抗剂(rhIL-1Ra)在动物体内的安全性,采用间接酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定rhIL-1Ra结合抗体,以纯化抗原作为包被载体,加入供试品后再加酶标抗体,用底物显色并在酶标仪上读取结果。结果显示,抗原包被浓度为10μg/mL、酶标二抗工作浓度为1∶5 000、阳性对照工作浓度为1∶10 000、待检血清样品稀释度从1∶100开始较为合适。SD大鼠肌肉注射给予rhIL-1Ra 4周试验中,剂量分别为0、5、15和30mg/kg。结果表明,剂量≥5mg/kg时给药2周后可诱导产生结合抗体。食蟹猴每天1次连续给药4周,剂量分别采用0、2.5、7.5和15.0mg/kg,当剂量≥2.5mg/kg时可诱导产生结合抗体。

pEGFP-N1/hIL-1ra重组真核表达载体的构建及其在人牙龈成纤维细胞中的瞬时表达

目的:构建重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)基因真核表达载体pEGFP-N1/hIL-1ra,瞬时转染人牙龈成纤维细胞并检测其表达,为牙周炎症的基因治疗提供实验基础。方法:TRIzol法提取人乳腺癌组织总RNA进行RT-PCR,将纯化的扩增产物hIL-1ra与克隆载体pMD18-T连接、转化,测序正确后将重组体pMD18-T/hIL-1ra与真核表达质粒pEGFP-N1分别进行双酶切,连接后转化感受态细菌E.coliTOP10。将构建正确的pEGFP-N1/hIL-1ra重组质粒DNA瞬时转染人牙龈成纤维细胞,荧光显微镜观察绿色荧光的表达,RT-PCR方法检测其基因的表达。结果:构建的pEGFP-N1/hIL-1ra真核表达载体经PCR及双酶切鉴定均表明人IL-1ra基因已与pEGFP-N1正确重组。瞬时转染人牙龈成纤维细胞后能观察到绿色荧光,RT-PCR可得到目的片段。结论:成功构建了重组质粒pEGFP-N1/hIL-1ra,瞬时转染人牙龈成纤维细胞后检测到其基因水平的表达,为炎性细胞因子拮抗剂基因用于牙周炎抗炎治疗奠定了实验基础。

重组人白细胞介素-1受体拮抗剂抗实验性肝纤维化作用

目的 :观察rhIL 1ra抗大鼠实验性肝纤维化的作用。方法 :以Wistar大鼠为实验观察对象 ,采用 40 5四氯化碳皮下注射 ,按每 1 0 0g体重 0 .3ml(首剂为 0 .5ml/ 1 0 0g体重 )皮下注射 ,每周 2次 ,共 1 6次 ,诱导肝纤维化模型。rhIL 1ra理组于实验第 1天开始注射四氯化碳时按每 1 0 0g体重 0 .5mg肌肉注射rhIL 1ra ,每日 1次。于实验 1 7、2 9、43、57日每组分别处死动物 6 1 0只 ,取血检测血清生化指标 ,取肝作组织学和Ⅰ、Ⅲ胶原和LN半定量分析。结果 :rhIL 1ra处理组各期大鼠血清ALT、AST及PCⅢ、CⅣ、LN及HA含量明显下降 ;实验 8周时肝纤维化程度明显减轻 ,Ito细胞增生受到抑制 ,肝组织内Ⅰ、Ⅲ型胶原和LN沉积明显减少。结论 :rhIL

重组人白细胞介素-1受体拮抗剂对大鼠胶原性关节炎的治疗作用

目的 研究重组人白细胞介素 1受体拮抗剂 (recom binanthumaninterleukin1receptorantagonist, rhIL 1ra)对大鼠胶原性关节炎 (collagen inducedarthritis,CIA)的治疗作用。方法 SD大鼠随机分为 6组:正常对照组、模型组、rhIL 1ra3个剂量组和进口IL 1ra组;采用Ⅱ型胶原(CⅡ)乳剂皮内注射诱导大鼠CIA模型;每周测体重观察体重变化;足爪容积法测量大鼠足爪肿胀度;测定CⅡ的迟发性变态反应(DTH);ELISA法检测血清中抗Ⅱ型胶原抗体水平;同时进行病理组织学的检查。结果 CIA大鼠在致炎d10,出现关节红、肿,体重减轻,血清抗CⅡ抗体水平升高,关节病理可见滑膜增生,炎性细胞浸润,血管翳形成,软骨和骨的破坏等。rhIL 1ra(7 5, 30, 120mg·kg-1 )和阳性对照组anakinra(120mg·kg-1 )皮下注射,连续 7d,能明显抑制CIA大鼠足肿胀;rhIL 1ra(30, 120mg·kg-1 )皮下注射,连续 7d,可以明显减轻CⅡ诱发的迟发性变态反应 (DTH);另外,rhIL 1ra也可明显降低CIA大鼠血清中抗CⅡ抗体的水平;病理学检查表明,rhIL 1ra大剂量能明显减轻CIA大鼠关节滑膜炎症和滑膜增生,减轻血管翳和软骨破坏。结论 rhIL 1ra对CIA具有治疗作用。

重组人白细胞介素-1受体拮抗剂在猕猴体内的药物代谢动力学研究

目的研究重组人白细胞介素-1受体拮抗剂（rhIL-1ra）在猕猴体内的药物代谢动力学特点,为后续的临床实验提供参考。方法猕猴肌肉注射3个剂量组（0.5、1.5、4.5 mg·kg-1）,中剂量组同时连续给药,高剂量组交叉静脉注射给药计算绝对生物利用度,用ELISA法测定给药后的血药浓度。结果 3个剂量组（0.5、1.5、4.5 mg·kg-1）单次肌肉注射给药后,主要药代参数如下所示：平均消除半衰期（t1/2）分别为（1.37±0.11）、（1.62±0.33）和（1.78±0.12）h,平均药时曲线下面积AUC（0~24h）依次为（2468±397）、（6446±2578）和（17 733±3702）ng·h·ml-1,清除率（CL/F）按剂量顺序依次为（0.21±0.03）、（0.28±0.16）和（0.26±0.06）L·kg-1·h-1。rhIL-1ra绝对生物利用度为（56.9±21.9）%。结论本实验报道了猕猴单次肌肉注射rhIL-1ra后呈线性药代动力学特征消除,连续给药7 d在猕猴体内基本无蓄积。

重组人白介素1受体拮抗剂对肝细胞的保护作用

目的·利用HepG2细胞建立D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-Gal N)体外肝细胞损伤模型,研究重组人白介素1受体拮抗剂(recombinant human IL-1Ra,rh IL-1Ra)对肝细胞的保护作用。方法·建立D-Gal N诱导HepG2细胞损伤模型,将HepG2细胞放置于含有不同浓度的D-Gal N培养基中(0.02、0.2、2、4 mg/m L),在第1、2和3日分别观察细胞形态和活力变化,优化D-Gal N浓度和处理时间;研究不同IL-1Ra浓度(10、20、50μg/m L)处理的D-Gal N损伤模型细胞形态变化,测定细胞活力;分析各组细胞凋亡情况和各组胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平,运用荧光实时定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)检测各组细胞中凋亡诱导相关细胞因子白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6 (interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的m RNA水平,并采用ERK1/2通路抑制剂(SCH772984)检测IL-1Ra是否是通过促进肝损伤细胞ERK1/2磷酸化的方式来保护肝细胞。结果·采用4 mg/m L浓度的D-Gal N处理HepG2细胞2 d后,细胞活力显著下降;rh IL-1Ra显著提高损伤模型细胞的存活率,减少细胞中ROS的生成,显著抑制D-Gal N诱导的细胞内凋亡诱导相关细胞因子的表达;ERK1/2信号途径在介导IL-1Ra保护肝细胞的损伤过程中有一定的作用。结论·rh IL-1Ra可直接靶向肝细胞,并通过在细胞内上调ERK1/2信号通路的活化水平,抑制细胞凋亡,发挥对肝损伤细胞的保护作用。

重组人白细胞介素-1受体拮抗剂制剂和沉淀中相关蛋白化学修饰类型的鉴定

目的 鉴定重组人白细胞介素-1受体拮抗剂(recombinant human interleukin-1 receptor antagonist,rhIL-1Ra)制剂和室温加速获得的制剂沉淀中相关蛋白的化学修饰类型。方法 利用反相高效液相色谱(reverse phase-high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)对rhIL-1Ra制剂和室温加速获得的制剂沉淀进行相关蛋白检测,并按面积归一化法确定相关蛋白的百分比;再用液质联用质谱法对rhIL-1Ra制剂和室温加速获得的制剂沉淀进行相关蛋白的鉴定。结果 RP-HPLC结果显示,rhIL-1Ra制剂中有6个相关蛋白色谱峰,所占百分比依次为0.414%、0.870%、0.871%、0.304%、0.104%、1.182%,rhIL-1Ra室温加速获得的沉淀中有5个相关蛋白色谱峰,所占百分比依次为0.350%、3.603%、1.118%、0.629%、0.866%。液质联用结果显示,rhIL-1Ra制剂6个相关蛋白色谱峰化学修饰类型分别为甲硫氨酸氧化、天冬氨酸脱水环化+甲硫氨酸氧化、甲硫氨酸氧化、甲硫氨酸氧化、天冬氨酸脱水环化、天冬氨酸脱水环化;rhIL-1Ra室温加速获得的沉淀中5个相关蛋白色谱峰化学修饰类型分别为甲硫氨酸氧化、天冬氨酸脱水环化+甲硫氨酸氧化、以甲硫氨酸氧化为主、以天冬氨酸脱水环化+甲硫氨酸氧化为主、以天冬氨酸脱水环化为主。结论 rhIL-1Ra制剂和室温加速获得的制剂沉淀的相关蛋白修饰类型相同,主要存在3种:甲硫氨酸氧化修饰、天冬氨酸脱水环化、天冬氨酸脱水环化+甲硫氨酸氧化,本研究为提高rhIL-1Ra制剂的质量提供了参考。

重组人白细胞介素-1受体拮抗剂卡那霉素抗性菌种的构建、表达、纯化及质量鉴定

目的构建卡那霉素抗性的重组人白细胞介素-1受体拮抗剂(recombinant human interleukin-1 receptor antagonist,rhIL-1Ra)菌种,并进行rhIL-1Ra蛋白的表达、纯化及质量鉴定,以降低β-内酰胺抗生素带来的风险。方法分别以氨苄抗性的质粒rhIL-1Ra(A-rhIL-1Ra)、pET-28a为模板,进行PCR扩增,获得线性化载体和卡那霉素基因片段,经同源重组构建卡那霉素抗性的质粒rhIL-1Ra(K-rhIL-1Ra),测序正确后转化E.coli BL21(DE3),构建重组工程菌,经IPTG诱导表达后,进行CM Bestarose Fast Flow、DEAE Bestarose Fast Flow两步柱层析纯化。收集纯化产物,15%SDSPAGE、分子排阻高效液相色谱法(size-exclusion high-performance liquid chromatography,SEC-HPLC)、反相高效液相色谱法(reversed-phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)检测纯度,串联质谱法检测质谱相对分子质量,Western blot法鉴定特异性,报告基因法检测生物学活性,液相色谱-质谱(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)法分析比对产品相关杂质。结果经菌落PCR及测序鉴定证明质粒K-rhIL-1Ra构建正确。表达的K-rhIL-1Ra蛋白相对分子质量约17000,主要以可溶性形式存在,表达量占菌体总蛋白的30%以上;两步纯化的K-rhIL-1Ra蛋白纯度分别为97%和99%,单体含量分别为99.33%和100%,色谱纯度分别为91.86%和96.96%,质谱相对分子质量与标准品(A-rhIL-1Ra蛋白)一致,可与小鼠抗人IL-1Ra单抗发生特异性反应;纯化的K-rhIL-1Ra蛋白生物学活性为1.29×10^(5)U/mg,相关蛋白化学修饰类型与标准品(A-rhIL-1Ra蛋白)一致。结论成功构建了K-rhIL-1Ra菌种,表达并纯化后的蛋白符合rhIL-1Ra的特征和质量标准,为rhIL-1Ra菌种变更及可比性研究奠定了基础。

重组人白细胞介素-1受体拮抗剂免疫大鼠ELISA抗体阳性血清中和抗体活性检测方法的建立及验证

目的 建立用于检测重组人白细胞介素-1受体拮抗剂(recombinant human interleukin-1 receptor antagonist,rhIL-1Ra)免疫大鼠ELISA抗体阳性血清中和抗体活性的方法,并进行验证。方法 分别用3、20、100 mg/kg的rhIL-1Ra注射液经皮下免疫SD大鼠,10只/组,雌雄各半,每天给药2次,间隔至少4 h,连续给药13周,于给药期及恢复期经大鼠颈静脉采血,分离血清,ELISA法检测血清抗体效价,Protein A层析柱纯化经ELISA筛选为rhIL-1Ra抗体阳性的血清样本。以D10G4·1细胞生物学活性试验为基础建立中和抗体活性检测方法,并验证方法的专属性、灵敏度及精密性。采用建立的方法检测ELISA筛选为rhIL-1Ra抗体阳性血清的中和抗体活性。结果 随着给药次数的增加,各剂量组大鼠血清抗体滴度逐渐增强,至恢复期时仍有抗体存在,且滴度仍较高。兔抗rhIL-1Ra单抗对rIL-1Ra有明显的中和作用,兔抗rIFN-2b单抗与rIL-1Ra无剂量效应关系;该方法的灵敏度为171.93μg/mL;精密性验证CV均≤20%。ELISA筛选为阳性抗体血清对rhIL-1Ra注射液均可产生中和效应,与ELISA法检测结果相符。结论 本研究建立了用于检测rhIL-1Ra免疫大鼠血清中和抗体活性的方法,具有良好的特异性、专属性及较高的灵敏度,可用于rhIL-1Ra重复给药动物血清中和抗体活性的检测。

重组人白细胞介素-1受体拮抗剂对急性肝衰竭小鼠肝脏保护作用的评价

采用(+)-D-氨基半乳糖盐酸盐(D-Ga1N)结合脂多糖(LPS)诱导小鼠急性肝衰竭(AHF)来评价重组人白细胞介素-1受体拮抗剂(rhIL-1Ra)对肝脏的保护作用。本研究用SPF级雄性C57BL/6小鼠建立AHF模型。造模前1 h,小鼠腹腔注射3、9 mg/kg的rhIL-1Ra或等体积的生理盐水(NS),注射造模药物后4 h采集小鼠血液和肝组织样本。分析各组小鼠循环中的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)水平和肝组织切片,并用荧光定量PCR方法分析肝组织中一氧化氮合成酶2(NOS2)和白细胞介素-6(IL-6)的表达水平变化。本研究还进一步通过死亡率试验考察rhIL-1Ra对AHF模型小鼠的保护作用。结果表明,9mg/kg剂量的rhIL-1Ra可以显著抑制AHF模型小鼠循环中的ALT和AST活性以及TBIL水平,减轻肝组织坏死和肝细胞变性程度,降低肝组织中NOS2和IL-6的表达。2个剂量(3和9mg/kg)的rhIL-1Ra都可以显著地改善AHF模型小鼠的生存率。结果表明,rhIL-1Ra在AHF药物开发和临床应用中具有潜在价值。