重组人干细胞生长因子(rhSCF)生物活性测定方法研究

目的 建立rhSCF生物活性测定方法。方法 分别采用MTT比色法与琼脂集落培养法进行rhSCF生物活性测定。结果 两种方法对同批次rhSCF成品测定结果无显著性差异。结论由于MTT比色法操作简便、稳定性好,可以替代琼脂集落培养法,使rhSCF测定更加准确、可行。

rhG-CSF和rhSCF对正常猴外周血白细胞和CFU-GM数的影响

为了观察重组人干细胞因子 (rhSCF)和 (或 )粒细胞集落刺激因子 (rhG CSF)动员外周血干细胞的效果 ,本研究将 15只正常成年猕猴分成 3组 ,每天 1次 ,连续 14天分别皮下注射赋形剂、rhG CSF 10 μg/ (kg·d)和rhSCF5 0 μ/ (kg·d) +rhG CSF 10 μ/ (kg·d)。结果表明 ,单独给rhG CSF组的外周血白细胞数最高值在给药后第 7天出现 ,为给药前值的 4 11% ,其后很快下降。联合给药组外周血白细胞数最高值在第 9天出现 ,为给药前值的 5 38% ,第 7至第 9天的外周血白细胞数在 5 35 % - 5 38%之间。单独给药组外周血CFU GM最高值在给药后第 5天为给药前值的 937% ,联合给药组在第 9天为 1175 %。结论 :rhG CSF对外周血干 /祖细胞有明显的动员作用 ,rhSCF +rhG CSF联合动员的效果优于rhG

rhSCF在大肠埃希菌中的高效表达及纯化

干细胞因子（SCF）是一种重要的造血生长因子，它在自体造血干细胞动员、肿瘤放疗化疗的辅助治疗以及其它血液病的治疗上具有良好的应用前景。为了制备高纯度、活性的重组人SCF，将人工合成的SCF的cDNA序列，克隆入原核表达载体pET43．1a中，转化大肠埃希菌BL21（DE3），获得了高效表达菌株。SCF通过诱导表达形成包涵体，包涵体经洗涤、变性和初步纯化后，进行直接稀释复性，复性液经离子交换层析、分子筛层析等分离除去共价二聚体和异构体，获得纯度大于95％的重组人SCF样品，生物学比活性在7．0×10^5U／mg以上。结果表明：建立了有效的rhSCF制备工艺，且产物具有较高的纯度和生物学活性。

rhSCF动员的外周血干细胞对7.0 Gy照射猴造血功能的影响

目的 观察经重组人干细胞因子 (rhSCF)或rhSCF +重组人粒细胞集落刺激因子(rhG CSF)动员后外周血干细胞移植对 7 0Gyγ射线照射猴的治疗效果。方法 15只猕猴分成照射对照、rhSCF和rhSCF +rhG CSF 3组。rhSCF 5 0 μg·kg- 1 ·d- 1 每天 1次 ,连续 8d皮下注射 ;单独注射rhSCF 3d后每天 1次皮下注射rhG CSF 10 μg·kg- 1 ·d- 1 ,给药 5d ;照射对照组同时给予等体积的生理盐水。照射前 4h收集外周血干细胞 (PBSC) ,7 0Gyγ射线照射后 2～ 3h回输PBSC ,观察其造血恢复情况。结果 单纯rhSCF动员的PBSC可促进照射猴外周血白细胞和血小板数的恢复 ,但不如rhSCF +rhG CSF联合动员组。单用rhSCF动员组各系集落数与照射对照组无明显差异 ,rhSCF +rhG CSF组的照后 30d的CFU GM、CFU Mix和CFU MK数明显高于照射对照组。照射对照组骨髓病理切片主要为脂肪细胞 ,而另两组骨髓腔内都可见到丰富的造血细胞 ,三系造血活跃。结论 rhSCF和rhSCF +rhG CSF动员的PBSC可促进 7 0Gyγ射线照射猴的造血功能恢复 ,两因子联用组的效果优于单因子组。

重组人干细胞因子生物学活性测定的质量控制研究

目的 :建立干细胞因子 (stemcellfactor,SCF)体外生物学活性测定方法 ,用于该制品生物学效价测定。方法 :应用类原巨核细胞白血病细胞系的UT 7细胞株 ,比较不同细胞浓度、培养时间等条件下应用MTT染色的效果 ,确定最佳实验条件 ,并用国家参考品校正SCF效价。结果 :UT 7细胞对SCF的反应存在量 效关系 ,并确定了最佳测定条件和剂量范围 ,效价测定重复性好 ,结果准确、客观 ,并用于重组SCF新生物制品的效价测定。结论 :已建立的UT 7细胞依赖株测定SCF生物学活性的方法可用于SCF的生物学活性的常规评价。

人SCF非融合蛋白的纯化及生物活性

将构建的可溶性ＳＣＦ表达质粒ＰＢＶＳＣＦ转化到大肠杆菌ＤＨ５α中进行非溶合蛋白表达，经克隆筛选出高效表达菌株表达量在２０％左右，大量扩增后经包涵体提取、液相层析技术纯化，得到纯度为９０％以上的ｒｈＳＣＦ制品，对其等电点和Ｎ端氨基酸进行分析，证实具有天然ＳＣＦ特性，生物活性检测表明该表达产物比活性为６６×１０５Ｕ／ｍｇ，同时可以协同ＧＭＣＳＦ促进人骨髓中ＣＦＵＧＭ增殖．重组人可溶性ＳＣＦ的获得对于实验室研究和临床应用具有一定价值．

人造血干细胞因子

干细胞因子（stem cell factor，SCF）是一种重要的造血生长因子，它在造血干细胞动员、肿瘤放疗化疗的辅助治疗、贫血、放射病及其他血液病的治疗等方面具有重要的应用前景。采用基因全合成的方法实现rhSCF基因的克隆和高效表达，表达水平达到30％～40％。在工程菌发酵、rhSCF纯化和复性等中下游技术研究的基础上建立了rhSCF生产工艺，回收率大为35％，纯化产物纯度不低于98％．比活性0．9×10^6U／mg。

基因工程人干细胞因子原核表达、纯化及生物学活性研究

目的：探索一种适合于中试生产的重组人干细胞因子（recombinant human stem cell factor,rhSCF）的发酵表达与纯化工艺。方法：研究不同培养基和热诱导时间对rhSCF表达量影响；探索最佳纯化工艺和各因素对rhSCF得率和生物学活性的影响。结果：rhSCF工程菌在含甘油、酪蛋白水解物、酵母浸出粉、胰蛋白胨及微量元素的培养基中表达量最高。灰度扫描显示热诱导后2h开始表达，6h表达量最高，目的蛋白约可达菌体总蛋白30％。高表达蛋白经复性后，可用酸沉淀作粗分离纯化，随后用阳离子交换层析分离，纯度达80％，经反相层析去除二聚体后，最后用DEAE柱浓缩后并经S200转换缓冲液，最终获得纯度＞95％和经活性＞6×10^5U/mg的rhSCF制品。结论：成功地建立了注射用rhSCF的中试生产工艺，为随后进行的临床前研究及临床试验奠定基础。

造血因子动员后自体外周血干细胞移植对急性放射病猴的治疗作用

目的 观察重组人粒细胞集落刺激因子 (rhG CSF)或rhG CSF +重组人干细胞因子 (rhSCF)动员后外周血干细胞 (PBSC)自身移植对 7 0Gyγ射线照射猴的治疗效果。方法 15只正常成年猕猴分成照射对照、rhG CSF和rhG CSF +rhSCF 3组。rhG CSF 10 μg/(kg·d) (μKD)连续 5天皮下注射 ,rhSCF 2 0 μKD连续 8天皮下注射 ,后 5天与rhG CSF联用。照射对照组注射等体积的生理盐水。照射当天收集PBSC ,7 0Gyγ射线照射后 3～4h做自体PBSC移植 ,观察其造血恢复情况。结果 在移植后恢复期rhG CSF +rhSCF组白细胞数明显高于对照组和rhG CSF组。rhG CSF+rhSCF和rhG CSF组外周血小板数的恢复优于照射对照组 ,骨髓CFU数明显高于对照组。病理组织学检查表明 ,rhG CSF组骨髓腔内造血细胞数量超过照射对照组 ,但比rhG CSF +rhSCF组少。结论 rhG CSF或rhG CSF +rhSCF组动员后自体PBSC移植可明显促进急性放射病猴的造血功能恢复 ,两因子联用组的效果优于单因子组。

人干细胞因子与其它造血生长因子对造血集落形成的协同作用

本文观察了含有人造血干细胞因子(rh-SCF)的重组质粒转染的COS7上清液,在半固体培养中,单独或协同rhGM-CSF、G-CSF、IL-3、EPO刺激人粒单系和红系造血祖细胞形成集落的影响。结果表明:单独rh-SCF对造血祖细胞集落形成无明显作用,SCF主要是协同其它因子,明显增加集落形成数量和集落的大小。

重组人干细胞因子对猕猴外周血干细胞的动员作用

给正常成年猕猴每天一次皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子 10 μg·kg-1·d-1(μKD)或 (和 )重组人干细胞因子 2 0、5 0和12 5 μKD ,前者给药 5天 ,后者 8天 ,观察国产重组人干细胞因子动员外周血干细胞的效果。结果表明 ,给药后外周血白细胞数最高值rhG CSF单独给药组为 2 0 6 % ,rhSCF单独给药为 2 0 0 % ,而两者联合给药后为 2 80 %～ 310 % ;外周血CFU GM较动员前分别升高 1 1、1 3和 5 8～7 9倍 ;3个联合动员组外周血CD34+ 细胞数分别为动员前的 2 0、2 4和 35倍。说明rhSCF对外周血干 /祖细胞有明显的动员作用 ,rhSCF+rhG

应用单克隆抗体免疫亲和柱纯化干细胞因子

应用抗人干细胞生长因子（ＳＣＦ）单克隆抗体，通过化学偶联方法制备成亲和层析柱，用于纯化大肠杆菌表达的可溶性重组人ｒｈ－ＳＣＦ．结果表明，经亲和柱纯化的样品经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测纯度达９５％以上，计算蛋白回收率为２３．４％，并且纯化后ｒｈ－ＳＣＦ生物活性明显高于纯化前样品．

检测重组人干细胞生长因子生物活性方法的改进

目的 比较检测重组人干细胞生长因子生物学活性的方法。方法 应用Mo7e细胞系MTT(四甲基偶氮唑盐 )比色、3H TdR掺入方法和CFU GM半固体检测技术 ,检测rhSCF和rhGM CSF生物学活性。结果 Mo7e细胞系MTT比色方法检测重组人SCF生物学活性与半固体集落培养技术以及3H TdR掺入具有同样的灵敏度。结论 该方法为研究SCF作用于造血干细胞的机理、信号传导以及临床前期的研究 。

重组人干细胞因子中试工艺研究

人干细胞因子(Human stem cell factor,hSCF)是一种重要的造血细胞因子,能刺激造血细胞的生长、增生与分化.本文在重组hSCF工程菌的基础上,通过高密度发酵培养、包涵体分离纯化、变复性、SP-Sepharose FF、Source 30RPC与Q-Sepharose FF层析等技术分离纯化出具有生物学活性的重组人干细胞因子,建立了适合大规模生产重组人干细胞因子的分离纯化工艺.纯化的rhSCF纯度达98%以上,生物活性为1·0×106IU/mg,各项质量检测指标均符合质量控制标准.该纯化工艺简单易行,一批次能制备克级样品,且产品回收率高,重复性好.

人干细胞因子在大肠杆菌中的表达研究

目的 经过改造重组人干细胞因子(human stem cell factor,hSCF),提高其表达量。方法 应用人工合成寡核苷酸引物及PCR技术,改变人干细胞因子hSCF cDNA起始密码子ATG与SD序列之间的距离及在翻译起始区(即N端氨基酸)部分采用大肠杆菌(E.coli)喜用型密码子的策略,使重组表达质粒pBV220-hSCF在E.coli中获得高效稳定表达。结果 DNA序列测定证明基因的阅读框架完全正确。重组人干细胞因子的表达量从改造前占E.coli总蛋白的12%提高到40%左右。纯化的重组hSCF N端17个氨基酸测序结果表明,除第一个氨基酸为甲硫氨酸外,其余与天然hSCF序列完全一致。纯化的重组hSCF经Western blot证明,与标准hSCF一致。结论 提示hSCF cDNA的5′侧翼区结构对其基因表达有显著的影响。

重组人干细胞因子与重组人粒细胞集落刺激因子联合用药的猴毒性研究

重组人干细胞因子(rhSCF)和重组人粒细胞集落刺激因子(rhG—CSD是临床常用的造血生长因子(HGF)，实验提示rhSCF和rhG—CSF与IL3、IL-6、粒-巨噬细胞刺激因子、Epo等造血生长因子的各种联合应用有增效作用。rhSCF和重组人粒／单集落刺激因子(rhGM—CSF)均能刺激CFU-GM生成，