通过检测证明rhSOD在癌症放疗、化疗综合症中的治疗作用

目的通过应用检测rhSOD对癌症患者在放疗、化疗综合症中的治疗作用中,有显著疗效。方法自2005年1月以来,我院应用rhSOD对高血压癌症、糖尿病、体弱者和其它疾病患者进行检测试验共60例,其中高血压15例,癌症放疗、化疗20例、糖尿病10例、体弱者15例,我科主要采用口服rhSOD对癌症放疗、化疗患者进行重点检测。结果 60例患者通过口服前口服后检测,患者状况大大好转,身体健康恢复很快。结论证明rhSOD对癌症放疗、化疗综合症具有明显的治疗作用。

重组人超氧化物歧化酶的基因克隆、表达及产物纯化研究

为了克隆人SODcDNA ,构建表达载体 ,实现其在大肠杆菌中的高效稳定表达 ,通过抽提人肝组织总RNA ,RT PCR扩增人SODcDNA ,构建含rhSODcDNA的表达质粒pLY 4/rhSOD ,转化大肠杆菌JF112 5进行表达研究。结果克隆到的rhSODcDNA序列与文献报道一致 ,在宿主菌中获得高效表达 ,表达水平达 6 8%以上 ;蛋白复性纯化工艺高效快速 ,rhSOD纯品纯度达 98%以上 ,比活性达到 2 5 2 9u/mg ;

重组人超氧化物歧化酶包涵体的复性和纯化

当工程菌接种量为3%～5%,菌体密度(D600)达0.4～0.6,并于42℃诱导3～5h时,目的蛋白表达量约为总蛋白的30%。采用透析法使包涵体复性,经金属螯合亲和色谱和凝胶色谱两步纯化后,获得了纯度约为90%、比活力达7300u/(mg蛋白)的重组人超氧化物歧化酶。

化学渗透法破碎基因重组E.coli提取重组人SOD包含体和复性

以化学渗透法破碎重组大肠杆菌细胞释放重组人超氧化物歧化酶(rhSOD)包含体并对其复性。选择四种化学试剂(Triton X-100、EDTA、NaOH和SDS)对rhSOD重组大肠杆菌细胞进行破碎实验,以SDS-PAGE检测破菌效果,结果0.5%Triton X-100和10 mmol·L-1 EDTA可以较好地破碎重组大肠杆菌细胞,所提取的包含体溶解液纯度与超声法相近,可达65%左右。采用透析法复性包含体,尿素终浓度0.1 mol·L-1时rhSOD包含体复性效果优于1.0 mol·L-1,比活分别为:Triton法2800 U·mg-1,EDTA法3200 U·mg-1,超声法2800 U·mg-1,复性rhSOD纯度达85%左右。本研究建立的用于破碎重组大肠杆菌释放rhSOD包含体的Triton法和EDTA法,包含体复性后比活等于或高于超声法,与机械破菌法相比,简便有效,成本低廉,无需特殊破菌设备,为放大规模破菌提取重组大肠杆菌包含体和复性奠定了实验基础。

以Triton X-100处理重组E.coli制备重组人SOD包涵体

为替代机械破菌法破碎重组E.coli释放重组人超氧化物歧化酶rhSOD(recombinant human SOD)包涵体蛋白,采用非离子表面活性剂Triton X-100处理重组E.coli释放并提取重组人超氧化物歧化酶包涵体.以SDS-PAGE检测破菌效果,采用透析法体外复性包涵体.结果表明:经体积分数0.5%的Triton X-100处理重组E.coli制备的包涵体纯度可达65%,复性48h,目的蛋白比活达2 801U/mg,纯度达90%以上.与机械破菌法相比,简单实用,成本低廉,易于放大,无需特殊破菌设备,为规模化生产提供参考.

重组人SOD1/3转基因山羊的制备及表达产物的检测

设计了以hSOD1、hSOD3为编码序列,以山羊β-酪蛋白/CMV杂合启动增强子构建乳腺特异性表达载体rhSOD1、rhSOD3,共转染母山羊胎儿成纤维细胞,采用PCR和扩增产物序列分析筛选获得SOD1/3克隆细胞株,应用体细胞核移植(SCNT)制备双转基因山羊。出生小羊经PCR和扩增产物序列分析验证是否成功整合外源基因,经Western blotting、ELISA及体外活性检来验证分析表达产物。结果表明:获得SOD1/3转基因山羊胎儿成纤维细胞系6株;原代双转基因体克隆山羊1只(♀);从该转基因羊乳汁中检测到rhSOD1、rhSOD3,浓度分别为:88.81±8.36 mg/L和267.82±12.67 mg/L;转基因羊乳汁中重组人SOD酶活性为1 432±157 U/mL。研究表明,以双载体和单标记基因转染山羊胎儿成纤维细胞可获得双基因整合转基因细胞系,并且以SOD1与SOD3功能基因均可在山羊乳腺中共同表达,表达产物具有较好的生物学活性。

从EDTA处理的重组E.coli中分离纯化重组人SOD包涵体

以金属离子螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)代替超声法使重组大肠杆菌菌体释放,并提取重组人超氧化物歧化酶包涵体,纯度为65%。采用透析法复性包涵体,经凝胶色谱纯化后,目的蛋白纯度约为90%,酶比活力为5400u/(mg蛋白)。

重组人超氧化物歧化酶加强一氧化氮吸入治疗幼鼠急性胎粪肺损伤的实验研究

目的 探讨联合应用重组人超氧化物歧化酶 (recombinanthumansuperoxidedismatase ,rhSOD)和一氧化氮吸入 (inhalednitricoxide,iNO)对胎粪诱导幼鼠急性肺损伤的保护作用及可能机制。方法 32只雄性SD幼年大鼠 ,通过气管置管注入 2 0 %胎粪 1ml/kg建立幼鼠胎粪性肺损伤模型 ,随机分为 :( 1)对照组 (Control,C) :暴露于空气中 ;( 2 )NO吸入组 (iNO) :暴露于 2 0× 10 - 6 NO中 ;( 3)rhSOD组 (SOD) ) :rhSOD 2 0mg/kg·ml气管内注入并暴露于空气中 ;( 4 )联合应用 2 0× 10 - 6 NO和 2 0mg/kgrhSOD组 (iNO/SOD) ,暴露 2 4h后观察支气管肺泡灌洗液 (bronchoalveolarlavagefluid ,BALF)细胞数、肺组织匀浆髓过氧化物酶 (myeloperoxidase ,MPO)活性、丙二醛 (malonyldialdehyde,MDA)、一氧化氮 (nitricoxide,NO)含量和肺损伤病理改变。结果 与对照组比较 ,iNO组、SOD组BALF细胞数、MPO活性、肺损伤病理评分下降(P <0 0 5或 0 0 1)、iNO/SOD组较iNO组BALF细胞数、MPO活性进一步降低 (均P <0 0 5 ) ;但肺损伤病理评分差异无显著牲 ;与对照组比较 ,iNO组肺组织MDA、NO含量略有下降 ,但差异无意义 (均P >0 0 5 ) ,SOD组、iNO/SOD组肺组织MDA、NO含量显著下降 (P <0 0 5或 0 0 1) 。

重组人SOD工程菌发酵表达条件的优化

采用正交试验优化重组人超氧化物歧化酶工程菌的LB培养基,得到培养基最佳配比(g/L):蛋白胨12,酵母膏5,葡萄糖1和氯化钠10。以此为基础优化基因工程菌发酵条件,确定培养基初始pH 6.5～7.5,装液量20%,菌体密度(D_(600))0.55～1.4,42℃诱导表达2～3 h,目的蛋白相对表达量由优化前的25%提高至41%,绝对表达量是优化前的2.4倍。