表达载体pRSET C重组rhTNF-β的表达及其纯化

将hTNFβN端缺失23个氨基酸的基因,克隆在表达载体pRSETC的6个组氨酸序列和肠激酶酶切位点序列的下游。以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,rhTNFβ获得了高表达,表达量占细菌总蛋白的26%。其表达产物大部分以可溶性形式存在。菌体裂解上清经0.45μm滤膜过滤后,用固定化金属配体亲和柱层析,纯度可达95%左右;经肠激酶酶切后,具有TNFβ的细胞毒活性,此活性为9.8×109U/g。

rhTNFα D11a对S180肉瘤的体内抗肿瘤作用

ｒｈＴＮＦαＤ１１ａ是利用基因工程技术制备的一种新型ＴＮＦ。体外在极低浓度下对多种人源性和鼠源性肿瘤细胞均有明显的细胞毒作用，与原型ｒｈＴＮＦα相比，其活性高１０倍以上；在小鼠和猴子体内进行的急性毒性和慢性毒性试验表明：其毒性比原型ｒｈＴＮＦα低约７倍。本文研究了ｒｈＴＮＦαＤ１１ａ在荷瘤小鼠体内的抗肿瘤作用，结果表明：瘤内注射１×１０４Ｕ的ｒｈＴＮＦαＤ１１ａ，７０％的动物肿瘤完全消失，其余动物肿瘤极显著减小，且发生组织重度坏死；注射１×１０３Ｕ，１０％的动物肿瘤完全消失，９０％的肿瘤不同程度地减小，肿瘤组织坏死程度以轻、中度为主；注射１×１０２Ｕ的动物肿瘤无明显减小，但生长率均显著低于对照组。

重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNFα)工程菌高密度发酵研究

报道了 rh TNFα重组菌发酵条件及高密度、高表达发酵的研究。首先研究了营养成份对其生长和表达的影响 ,确定了半合成发酵培养基 ;筛选出了 rh TNFα生长和表达的最适宿主菌 E.coli YK5 37;研究了影响高表达的几个关键因素 ,建立了该类型重组菌的诱导表达条件。结果表明限制发酵过程中乙酸积累、控制在指数生长期进行诱导、持续诱导时间不超过 5 h是实现高密度、高表达发酵的关键条件。采用半经验补料流加公式 ,在 NBS Bio Flo30 0 0型 5 L 发酵罐中利用恒溶氧 -补料培养批技术 ,限制甘油浓度在 5 g/ L,可使 E.coli YK5 37/ p SB- TR最终菌体密度和 rh TNFα的产量分别达到 A6 0 0 12 6和 8.4g/ L。

rhTNFα加rhIL-2诱导小鼠CNE3细胞凋亡和抑制增殖的体内实验研究

目的：研究重组人肿瘤坏死因子（rhTNF－α）对鼻咽癌细胞敏感性、重组人白细胞介素－2（rhIL－2）协同抗瘤效应及抗瘤机理。方法：利用我室建立的鼻咽癌细胞株（CNE3）制成的裸鼠鼻咽癌模型，rhTNFα通过与rhIL－2配伍瘤内注射以观察移植瘤超微结构及免疫组织化学的改变，探讨其作用机理。结果：鼻咽癌裸鼠移植瘤经治疗后出现坏死、体积缩小、甚至消失；超微结构观察凋亡细胞缩皱，核内异染色质边集；免疫组化研究发现：rhTNF－α有下调（突变型）p53和增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白表达，其可能与rhTNF－α的抗癌机理有关；rhIL－2能增强rhTNF－α的抗瘤作用。结论：rhIL－2增强rhTNF－α的抗瘤机理可能与IL－2诱导癌细胞表达TNF受体作用有关，该研究为临床在鼻咽镜下进行TNF局部治疗提供实验依据。

重组人肿瘤坏死因子(rhTNF-α)国家标准品的研制

目的:建立符合WHO重组细胞因子要求,用于rhTNF质量控制的国家标准品.方法:用NIBSC提供的国际标准品为标准,采用L929细胞体外活性测定系统,按统一方案组织了4家实验室,对这批rhTNF-α国家标准品(批号960508)的效价进行协作标定.结果:经统计学分析,均数的95%可信区间为3289～4266IU/支,单次测定的95%标准值范围为1735～8087IU/支.这批国家标准品效价确定为3500IU/支.4种不同温度存放27个月的样品,效价测定结果表明其效价稳定.结论:这批rhTNF-α经统一协作,质量可靠,效价稳定,可用作国家标准品使用.

重组人肿瘤坏死因子α(rhTNFα)衍生物的纯化及检定

采用热处理、盐析和离子交换层析技术对新型人肿瘤坏死因子α衍生物 (命名为hTNFD)蛋白进行了纯化 ,纯化后的纯度大于 96 % ,回收率为 43.8% ,纯化倍数为 6 .4倍。经L92 9细胞测活结果表明 ,hTNFD的比活可达 1.0 1× 10 1 0 U mg ,比原型TNFα活性提高 46 5倍 ,整个纯化工艺简单、稳定 ,易于放大 ,显示出较好的临床应用前景 ,

rhTNF瘤内注射致膀胱癌的超微结构改变

FNF是迄今所知抗肿瘤作用最强的细胞因子,体内外实验均表明TNF对多数肿瘤具有杀伤或细胞抑制(cytostasis)作用。但因其剂量依赖性毒副作用,加之生物半衰期短,全身应用难以在局部达到有效浓度而限制了临床应用。增加应用剂量常引起寒战、高热、低血压、甚至发生恶液质等严重副作用。目前对TNF的研究侧重于分子修饰,改变应用策略等方面,以提高疗效,减少不良反应。

FCA包裹rhTNF对结肠癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的：探讨增强ＴＮＦ抗结肠癌作用的方法。方法：建立人结肠癌裸小鼠移植瘤模型，观察ＦＣＡ包裹ｒｈＴＮＦ对移植瘤体积、瘤重及抑瘤率等变化的影响。结果： ＦＣＡ包裹ｒｈＴＮＦ对人结肠腺癌裸小鼠移植瘤体积、瘤重、生长及抑瘤率等抑制作用均较ｒｈＴＮＦ明显增强；对裸小鼠体重及全身情况的影响较单用ｔｈＴＮＦ明显减轻。结论：ＦＣＡ增强ｒｈＴＮＦ的抗结肠癌作用、减轻ｒｈＴＮＦ的副作用，可能与ＦＣＡ包裹后使ｒｈＴＮＦ在肿瘤灶内持续缓慢释放、半衰期延长有关。

联合应用rhTNF和环磷酰胺治疗胶质瘤大鼠的效果及其机制

目的:探讨联合应用rhTNF和环磷酰胺治疗胶质瘤大鼠的效果及其可能机制。方法:制备胶质瘤大鼠模型,动态监测经颈总动脉给予rhTNF后的血肿瘤屏障开放程度。给予rhTNF 120 min再给予CTX后,ELISA法测定胶质瘤组织内CTX的含量。观察分别给予rhTNF、CTX和rhTNF(120 min)+CTX的胶质瘤大鼠的生存时间。结果:给胶质瘤大鼠注射rhTNF后,血肿瘤屏障开放程度增加,于120 min达最大后开始减小。给予rhTNF 120 min再给予CTX后,胶质瘤组织内CTX含量明显高于单独给予CTX组。与其他组相比,rhTNF(120 min)+CTX能明显延长胶质瘤大鼠的生存时间。结论:胶质瘤大鼠给予rhTNF 120 min时血肿瘤屏障开放程度最大,此时进入胶质瘤组织的CTX含量最多。

rhTNFα与IL-2联合瘤内注射致鼻咽癌移植瘤超微结构的改变

应用 CNE- 3鼻咽癌细胞株作为靶细胞 ,建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型 ,探讨rh TNFα与 IL- 2联合瘤内注射对鼻咽癌裸鼠移植瘤形态学的影响。结果显示 :单独应用rh TNFα早期鼻咽癌细胞缩小 ,异染色质增多和出现凋亡小体 ,联合应用后癌细胞改变出现时间早、程度重 ,表现为内质网扩张 ,核固缩 ,核碎裂 ,癌细胞坏死及淋巴细胞反应。提示rh TNFα和 IL- 2有不同程度协同杀伤鼻咽癌细胞的作用 ,促使癌细胞趋向死亡。该研究为临床术前 rh

rhTNF-α联合IL-2对急性髓细胞白血病患者骨髓体外净化的研究

目的 探讨重组人肿瘤坏死因子α(rhTNF -α)联合白细胞介素2(IL-2)对急性髓细胞白血病 (AML)骨髓体外净化的作用。 方法 rhTNF -α(1000u/ml)和IL-2(500u/ml)联合 ,对17例AML患者骨髓体外净化培养1～3d,用甲基纤维素半固体培养法测定粒 -巨噬细胞集落 (CFU -GM)、白血病祖细胞 (CFU -L)形成 ,并以免疫组化法测定CD33、CD38和CD34阳性表达率的变化。结果 (1)rhTNF-α对8例正常人和17例患者的CFU -GM均有明显的抑制作用 ,而与IL -2联合作用对CFU-GM则无明显影响 ;(2)单用rhTNF-α或IL-2与患者骨髓共同孵育1d和3d,CFU -L形成率均有所下降 ,但至孵育3d后 ,尚残余20%、6%的白血病克隆 ,不能完全根除CFU-L;而两者联合作用3d后 ,CFU -L抑制率达100% ;(3)17例AML患者骨髓经rhTNF-α、IL-2净化培养3d后 ,白血病细胞CD33、CD38和CD34阳性表达率发生了明显变化。 结论 (1)单用rhTNF -α或IL-2净化效果不理想 ;(2)rhTNF-α联合IL-2对CFU -L有选择性杀伤作用 ,而对正常CFU -GM无明显影响 ,净化效果较好 ;(3)白血病细胞CD33、CD38、CD34阳性率的变化可间接评价AML骨髓净化效果。

转基因蓝藻制备α型重组人肿瘤坏死因子衍生物

应用ＤＮＡ重组技术将ａ型重组人肿瘤坏死因子衍生物（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒａ，ｒｈＴＮＦａ）ｃＤＮＡ插到穿梭质粒ＰＤＣ－８上，构建成穿梭表达载体ＰＤＣ－ＴＮＦ，转入鱼腥藻ＰＣＣ－７１２２０中进行表达。

注射用重组人肿瘤坏死因子α衍生物a的临床药代动力学

目的：测定重组人肿瘤坏死因子α衍生物 a（ recombined human tumor necrosis factorα derivative, rhTNFα Da）在人体内的药代动力学。方法： 6例肿瘤患者在 50 min内静脉匀速滴注 rhTNFα Da 4× 106 IU，用双抗体夹心法测定血清中 rhTNFα Da的浓度。结果：血浆浓度时间曲线呈二室模型， K12、 K21、 K10分别为 1.73 h－ 1、 5.54 h－ 1、 0.88 h－ 1， T1/2α： 0.1057 h± 0.0125 h,T1/2β： 1.53 h± 0.34 h；表观分布容积 V： 0.623 L· kg－ 1； AUC:452.4 ng· h－ 1· L－ 1± 103 ng· h－ 1· L－ 1,CL:1.096 L· kg－ 1。结论： rhTNFα Da是一个快速消除的药物，建议 rhTNFα Da进一步临床研究可考虑调整给药方案或制成缓释制剂。

用电喷雾质谱法监测重组人肿瘤坏死因子中二硫键的还原过程

应用电喷雾质谱方法动态监测了用巯基乙醇及二硫苏糖醇还原重组人肿瘤坏死因子中二硫键的全过程，表明使用巯基乙醇还原二硫键速度较二硫苏糖醇快，并且在还原过程中有质量加和产物生成，还原过程易于观察，可为进一步对蛋白质酶切进行结构鉴定提供监测方法；利用该法还可测定分子中二硫键的数目。

肿瘤坏死因子联合化疗药物抗Walker-256肿瘤细胞的研究

目的 :研究重组人肿瘤坏死因子 (rhTNF)及其联合化疗药物的体外杀伤肿瘤细胞的作用。方法 :采用体外细胞毒方法 (MTT)及流式细胞仪分析法检测重组人肿瘤坏死因子或 /和阿霉素 (ADM)对大鼠Walker 2 5 6肿瘤细胞作用后的细胞毒性及细胞分裂周期各时象的变化。结果 :rhTNF有很强的抗瘤活性 ,与阴性对照组比较有显著差异 (P <0 .0 1) ,并有很好的量效关系 (Υ =0 .9811) ,与ADM联用表现有协同增强细胞毒性 ;rhTNF使G2、S期细胞减少 ,增殖指数 (PI)降低 ,与ADM联用 ,其作用更加显著。结论 :rhTNF与ADM联用对Walker 2 5 6肿瘤细胞有协同增强的杀伤作用。

癌组织衍生肿瘤坏死因子抑制因子的初步研究

将３０份手术切除的新鲜结直肠癌组织块直接作原代培养４８ｈ后，观察培养上清中免疫抑制因子的存在及特性。结果表明：此癌组织培养上清可抑制人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）产生肿瘤坏死因子（ＴＮＦα）并抑制重组人肿瘤坏死因子（ｒｈＴＮＦα）杀伤靶细胞的活性，两种作用均呈剂量依赖性。对抑制ｒｈＴＮＦα杀瘤活性的因子初步纯化的结果证实，其为分子量约４０ＫＤ的蛋白质。此外，为保证结直肠癌组织培养不污染，本工作对癌组织培养前的无菌消毒方法做了探索，找出最佳处理方案，即“７５％酒精－灭滴灵－多种抗菌素”模式。

突变型与野生型TNF-α诱导肿瘤细胞的凋亡

目的比较重组人突变型471rhTNF-α(mt471rhTNF-α)与野生型rhTNF-α(wt rhTNF-α)诱导肿瘤细胞发生凋亡的能力,并对mt471rhTNF-α诱导肿瘤细胞发生凋亡的作用机制进行初步研究.方法以乳腺癌细胞系ZR75-1细胞为靶细胞,应用基因组DNA琼脂糖凝胶电泳及流式细胞技术分析mt471rhTNF-α与wt rhTNF-α诱导肿瘤细胞凋亡的情况;利用以ELISA为基础的Trans AMTM NF-κB p65试剂盒检测经mt471rhTNF-α或wt rhTNF-α处理的ZR75-1细胞核因子NF-κB的活化情况,以便对其诱导凋亡的机制进行初步的研究.结果20g/L琼脂糖凝胶电泳显示,mt471rhTNF-α处理组的ZR75-1细胞基因组DNA呈现明显的ladder状分布,wtrhTNF-α处理组的“ladder”条带明显减弱;流式细胞仪分析显示,mt471rhTNF-α诱导的细胞凋亡峰面积高于wt rhTNF-α处理组.NF-κB活化检测结果显示,当两型rhTNF-α浓度增高到50μg/L时,wt rhTNF-α处理组的NF-κB的活化量明显高于同浓度的mt471rhTNF-α处理组(P=0.002).结论mt471rhTNF-α诱导肿瘤细胞凋亡的能力明显优于wt rhTNF-α;肿瘤细胞内NF-κB活化明显受抑是mt471rhTNF-α诱导凋亡能力增强的主要原因之一.

人干扰素/β肿瘤坏死因子重组杂合蛋白的免疫调节功能

报道了人干扰素／β肿瘤坏死因子（ｒｈＩＦＮ－／ｒｈＴＮＦ－β）杂合蛋白对正常动物免疫反应的影响，结果如下：经ＬＰＳ激活的豚鼠腹腔巨噬细胞，当与适宜剂量的杂合蛋白温育后，其无细胞上清液中的Ｈ２Ｏ２浓度高于对照组。ＤＮＣＢ致敏的大鼠在半抗原攻击前，如在一侧耳翼内注入适宜剂量的ｒｈＩＦＮ－／ｒｈＴＮＦ－β，则由ＤＮＣＢ诱导的迟发超敏（ＤＴＨ）反应大于在另一侧耳翼内注入ＰＢＳ作为对照的反应强度。在抗体形成细胞（ＡＦＣ）反应检测系统中，经异种红细胞致敏的小鼠免疫脾细胞用杂合蛋白做短暂处理后，其ＡＦＣ反应比对照组有所增强。

银杏叶提取物EGb761对TNF-α诱导HeLa细胞凋亡的影响

目的 初步研究银杏叶提取物EGb761对重组人肿瘤坏死因子- α(rhTNF- α)诱导HeLa细胞凋亡的影响。方法 采用MTT法观察EGb761对HeLa细胞生长的影响;细胞凋亡实验分5组,即空白对照组,rhTNF -α对照组(10 0 μg/L ) ,EGb761低浓度组[rhTNF- α(10 0 μg/L) +EGb761(10mg/L) ] ,EGb761中浓度组[rhTNF -α(10 0 μg/L ) +EGb761(2 0mg/L ) ] ,EGb761高浓度组[rhTNF -α(10 0 μg/L) +EGb761(4 0mg/L) ] ,采用流式细胞术和Hoechst3 3 2 5 8荧光染色检测凋亡。结果 EGb761在5 .0～80 .0mg/L终浓度范围内对HeLa细胞生长无明显影响;流式细胞术测定各组亚倍体细胞峰积分百分率(% )为:空白对照组(5 .3 5±2 .2 ) ,rhTNF- α对照组(3 7.8±6.1) ,EGb761低浓度组(19.2±3 .4) ,EGb761中浓度组(16.5±5 .7)和EGb761高浓度组(11.3±3 .9) ;荧光染色检测各组凋亡百分率(% ) :对照组(4 .2 3±2 .0 )、rhTNF α对照组(2 7.8±4.3 )、EGb761低浓度组(14 .9±3 .4)、EGb761中浓度组(12 .1±3 .7)和EGb761高浓度组(9.61±2 .3 ) ;结果显示,EGb761在10～40mg/L终浓度范围内对rhTNF α诱导的HeLa细胞凋亡均有显著的抑制作用(P <0 .0 1) ,且呈剂量依赖关系。结论 EGb761能有效抑制rhTNF- α诱导的HeLa细胞凋亡。