嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)JC1重金属抗性及其解毒蛋白生物信息学分析

为研究某些重金属解毒蛋白在微生物抗重金属过程中发挥的作用,从常年受重金属污染的某化工厂附近土壤中分离、驯化得到一株对铅、铜、镉3种金属有较好抗性的嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)JC1,并对其进行了全基因组测序。通过分析其蛋白家族、代谢通路等,发现蛋白质AHY58868.1、AHY59763.1、AHY58405.1和AHY57635.1与重金属解毒直接相关,故利用分析软件对4种蛋白的生物学性质、结构功能和相互作用等分别进行了分析。生理生化试验结果表明,菌株JC1表面光滑,菌落边缘整齐,为无芽孢的革兰氏阳性菌,Pb^(2+)、Cu^(2+)和Cd^(2+)的去除率最高分别可达76.9%、96.7%和47.7%。生物信息学分析结果表明,AHY58405.1为不稳定的亲水性蛋白,而其余3种为相对较稳定的亲水性蛋白。AHY58868.1和AHY59763.1无信号肽结构,而AHY58405.1和AHY57635.1存在信号肽结构。AHY58868.1和AHY57635.1于细胞内膜发挥作用,AHY59763.1在细胞质内发挥作用,AHY58405.1在周质空间发挥作用。蛋白质结构功能和蛋白间相互作用关系分析表明,AHY58868.1主要参与机体铜离子的转运,对维持细胞内铜平衡起关键作用;AHY59763.1和AHY58405.1主要介导重金属与某些阴离子(—PO4^(3-)、—SH、—NH_(2)、—COOH等)基团的络合,尤其是AHY59763.1在微生物体内可为二价重金属的络合提供多个活性位点;AHY57635.1主要参与机体的ABC转运蛋白的转运过程,可介导重金属向胞外的排出。

一株产电菌嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)的分离及其产电性能优化

本研究以天津泰达污水处理厂污泥浓缩间的污泥为接种物,启动并运行了微生物燃料电池(MFCs).从富集的阳极生物膜上分离得到了一株纯培养的微生物菌种,命名为P2-A-5.研究发现,菌株P2-A-5的16S rDNA序列与菌株Kocuria rhizophila DC2201具有100%的同源性,结合该菌的形态特征和生理生化实验,将其归属为嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila).通过化学剂处理、底物种类和浓度的优化,进一步提高其在微生物燃料电池中的产电性能.结果表明,菌株K.rhizophila P2-A-5经0.5 mg·L-1溶菌酶处理45 min后,接种到以2.0 g·L-1海藻糖为底物的阳极液中运行MFCs,其功率密度达到314.8 m W·m-2,比优化前(74.9 m W·m-2)提高了320.3%.这是首次对K.rhizophila种内微生物产电性能及其在微生物燃料电池中应用的报道,其成果对于丰富产电微生物的多样性,挖掘更多具有高电化学活性的微生物菌种,提高其产电性能具有重要的理论意义.

转运蛋白在细菌吸附铜(Ⅱ)中的作用机理研究

为研究转运蛋白在细菌响应铜(Ⅱ)胁迫中发挥的作用,从Transporter Classification Database(TCDB)数据库中检索得到嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)JC1基因组中4个参与Cu(Ⅱ)吸附、转运和外排的转运蛋白,并对其结构和功能进行分析。此外,研究菌株JC1对不同质量浓度的Cu^(2+)的吸附能力和耐受能力,并利用扫描电镜(SEM)、能量色散X射线光谱仪(EDS)和傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)分别分析Cu^(2+)胁迫后,菌株JC1的形态学、元素组成和官能团的变化。结果显示,菌株JC1可耐受Cu^(2+)的质量浓度为160 mg/L,但对120 mg/L Cu^(2+)有最大吸附率,为72.3%。经Cu^(2+)胁迫后,菌株JC1光滑的杆状结构消失,表面褶皱、呈短杆状,且其元素组成中出现了3个Cu^(2+)吸收峰。FT-IR分析结果表明,—OH、—C—O和—C—C等官能团在菌株JC1胞外吸附Cu^(2+)中发挥了重要作用。对4个转运蛋白质的结构分析结果显示,铜稳态蛋白cutC同源物存在于细胞质中,其氨基酸序列中有多个Cu^(2+)结合位点,可为菌株JC1吸附Cu^(2+)提供条件。铜抗性蛋白A位于周质空间,其特异性负责对Cu^(2+)的吸附。CopB是一种外膜孔蛋白,其氨基酸中含有的N、O、P等元素为菌株JC1与重金属的结合提供了电子。另外,菌株JC1的铜转位P-ATPase属于P1B-ATPase,含有8个跨膜结构,其中N-端含有丰富的组氨酸残基在菌株JC1结合Cu^(2+)过程中发挥重要作用。

嗜根考克氏菌K45对发酵猪肉品质的影响

为了研究嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)K45对发酵猪肉品质的影响,以自然发酵肉为对照组,通过测定发酵组的色度、挥发性风味化合物和游离氨基酸等探究菌株K45对发酵肉品质的影响。结果表明,菌株K45发酵组红度a*值显著高于自然发酵组(P<0.05),添加菌株K45能促进发酵肉发色;游离氨基酸含量为(365.97±3.68)mg/100 g,显著高于自然发酵组(P<0.05);两组发酵肉中共检测到136种挥发性风味物质,菌株K45发酵组中检测到131种,有8种挥发性物质仅在菌株K45发酵组被检出,说明菌株K45可以促进发酵肉滋味和香味的形成。通过火山图分析结合相对气味活度值(ROAV)结果,发现菌株K45发酵组的特征性风味物质为双乙酰、三甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、3-甲基丁醛、2-甲基丁酸乙酯、2,3-二甲基吡嗪和萘;特征呈味氨基酸为天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、精氨酸和酪氨酸。综上,接种菌株K45发酵可改善发酵肉制品的色泽和整体风味。

转录组分析揭示盐酸克林霉素胁迫下嗜根考克氏菌DC2201的响应机制

【目的】研究0.5倍最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)的盐酸克林霉素胁迫下,嗜根考克氏菌DC2201的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),揭示盐酸克林霉素胁迫下嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)DC2201的响应机制。【方法】以LB液体培养基培养的嗜根考克氏菌DC2201细胞为对照,采用Illumina HiSeq测序平台进行RNA-seq双端测序,分析0.5 MIC的盐酸克林霉素胁迫下嗜根考克氏菌的基因表达情况,并采用实时荧光定量PCR方法验证。【结果】从盐酸克林霉素胁迫下的嗜根考克氏菌中共筛选到1202个显著DEGs,其中显著上调表达基因604个,显著下调表达基因598个。经基因本体论(gene ontology,GO)注释,筛选到分子功能(molecular function,MF)、细胞组分(cellular component,CC)和生物学过程(biological process,BP)3个一级分类指标,35个二级分类指标共1041个显著DEGs。经京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)注释,筛选到与DNA修复途径相关的显著DEGs 16个,与核糖体合成途径相关的显著DEGs 43个,与ATP结合盒(ATP-binding cassette,ABC)转运蛋白相关的显著DEGs 28个,与戊糖磷酸途径、糖酵解、三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循环、淀粉与蔗糖、丙酮酸、丁酸等碳水化合物代谢相关的显著DEGs 77个,与肽聚糖合成相关的显著DEGs 5个。【结论】盐酸克林霉素胁迫下,嗜根考克氏菌DC2201的响应机制是一个全局性反应机制,细菌通过增强多重耐药性(multidrug resistance,MDR)家族的主要促进者超家族(major facilitator superfamily,MFS)转运体的表达来增加对盐酸克林霉素的外排,通过增强DNA修复和RNA代谢途径,以保证基因组的稳定性和RNA的正常功能,通过增强核糖体合成途径来弥补盐酸克林霉素与自身50S核糖体结合后导致的蛋白质合成障碍,以提高蛋白质合成效率。与此同时,减少碳水化合物的吸收和转运,抑制自身的能量代谢途径,以减缓自身的生长速率而降低对能量的需求,相应地,细胞壁的稳定性也受到影响。

DSF型群体感应系统的缺失导致嗜根寡养单胞菌溶藻作用的增强

水环境中的微藻与藻际微生物之间关系复杂多变,而微生物的群体感应(QS)作用会影响并调控菌藻的共生关系。以嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)野生株(WT)和QS扩散信号因子(DSF)合成酶基因-rpfF基因敲除株(△rpfF)为实验菌株,阐明DSF型群体感应是否调控嗜根寡养单胞菌对铜绿微囊藻的溶藻效果。结果表明:嗜根寡养单胞菌野生株和rpfF基因敲除株的溶藻特性相似,均具有针对铜绿微囊藻的溶藻特异性,主要通过分泌溶藻物质间接作用于藻细胞;野生株和敲除株培养48 h后的无菌滤液均有显著的溶藻作用,在投加体积分数10%无菌滤液的条件下,野生株和敲除株7 d溶藻率分别为53%和78%。此外,实验菌株分泌的溶藻活性物质具有热稳定性和酸碱耐受性,且不容易被乙醇沉淀;三维荧光光谱、紫外可见光光谱、傅里叶变换红外光光谱分析表明菌株胞外滤液中主要以类腐殖酸物质为主,芳香化程度较高;通过比较荧光强度和吸光度可知DSF合成酶基因缺失的嗜根寡养单胞菌的无菌滤液中类腐殖酸物质含量显著高于野生株。结果表明,DSF-QS缺失的嗜根寡养单胞菌生物量增多,能分泌更多的溶藻物质,增强了嗜根寡养单胞菌的溶藻作用。本研究拓宽了对菌藻互作的认识,有助于更好地理解溶藻菌对有害藻华的抑制机制,同时为以微生物菌剂治理水华的技术体系提供参考。

嗜根寡养单胞菌DSM 14405~T对高浓度Cr(Ⅵ)的抗性及其还原特性分析

为了寻找植物-微生物联合治理Cr(Ⅵ)污染的合适微生物,分析了一株植物根际促生菌--嗜根寡养单胞菌DSM 14405^T(Stenotrophomonas rhizophila DSM 14405^T)对不同浓度Cr(Ⅵ)的还原能力、Cr(Ⅵ)还原最适培养条件、对连续投加Cr(Ⅵ)的还原能力及高浓度Cr(Ⅵ)处理不同时间的转录组变化.结果表明,嗜根寡养单胞菌DSM 14405T在24 h内对10、50、200和500 mg·L^-1 Cr(Ⅵ)的还原率分别为100%、92.4%、26.2%和16.5%,且在30℃、pH=7.5、转速180 r·min^-1条件下培养能最经济、高效地还原Cr(Ⅵ).该菌能在64 h内完全还原2次所投加的50 mg·L^-1的Cr(Ⅵ),第3次投加后仅能还原55.2%左右.比较转录组学分析可得,200 mg·L^-1Cr(Ⅵ)作用下,嗜根寡养单胞菌DSM 14405^T细胞表现出显著的抗性.具体表现为:大幅度上调胞内消除有毒自由基的相关基因、DNA修复相关基因以防止DNA因自由基受损,同时下调细胞组分及蛋白代谢等与细胞抗性相关性低的通路.并且,随着Cr(Ⅵ)的还原和细胞对环境的适应,Cr(Ⅵ)抗性相关基因及通路的调节在长时暴露中明显少于短时暴露.本研究为Cr(Ⅵ)污染的原位植物-微生物联合治理提供了可选菌株和理论依据.

炭样小单孢菌JXNU-1产抗生素JX对嗜根考克氏菌肽聚糖合成的影响及其机理

为了揭示一株具有广谱抗菌活性炭样小单孢菌JXNU-1产的核苷类抗生素JX对嗜根考克氏菌肽聚糖合成的影响,本研究采用超声破壁、称重法研究抗生素对嗜根考克氏菌细胞壁含量变化,采用iTRAQ技术对抗生素处理前、后嗜根考克氏菌的蛋白质组进行比较分析。结果显示,在抗生素JX作用下,嗜根考克氏菌细胞分裂被抑制,细胞壁含量升高;iTRAQ技术鉴定了抗生素胁迫下的嗜根考克氏菌细胞中的1 780个蛋白,其中差异表达蛋白149个,包括表达上调蛋白106个,表达下调蛋白43个,上调表达蛋白中包括有一与肽聚糖合成的相关酶MurG。本研究为揭示炭样小单孢菌JXNU-1产抗生素JX的抗菌作用机制提供了基础数据。

嗜根考克氏菌双组分信号转导系统的生物信息学分析

双组分信号转导系统(two-component system,TCS)是细菌感知和响应环境的普遍机制,由组氨酸激酶(histidine kinase,HK)和应答调控蛋白(response regulator,RR)组成,它们能够使机体根据环境条件的改变做出适当的细胞反应。嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)是一种抗生素活性测试的常用质量控制菌株,但目前有关它的TCS研究尚不多见。为研究TCSs在细菌生存适应中的潜在作用,采用生物信息学的方法对已完成基因组测序的8个嗜根考克氏菌菌株的TCSs进行数量统计、结构分析以及功能预测。研究结果显示,嗜根考克氏菌中共存在13种TCSs,且HKs和RRs都是模块化蛋白质,参与外界压力应答、细胞壁合成、酶活性、物质代谢与运输等生命活动。本研究关于TCSs的研究将有助于系统的理解嗜根考克氏菌以及相关物种,为构建该菌的TCS调控网络提供依据,并可推动其在工业上的应用。