铜绿假单胞菌Quorum-Sensing系统中rhlR基因的克隆表达及其免疫保护性研究

目的研究铜绿假单胞菌rhlR表达产物的分子生物学特性,以及对小鼠的免疫保护作用。方法以铜绿假单胞菌标准株PAO1的基因组DNA为模板,PCR方法扩增rhlR基因。利用pGEX4T-1载体构建rhlR-pGEX4T-1重组质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并用免疫印迹验证。同时用纯化的重组蛋白免疫小鼠,菌落计数法检测免疫组和对照组鼠肺对铜绿假单胞菌的清除率。结果rhlR的全基因序列为726bp,经序列分析和同源性比较,与GenBank中的rhlR基因(登录号:AE004768)完全一致。大肠杆菌BL21(DE3)转化重组质粒rhlR-pGEX4T-1后,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,表达的融合蛋白质相对分子质量为54×103,其中RhlR蛋白为27×103。体内实验中,免疫小鼠肺部对铜绿假单胞菌的清除率与未经免疫的正常组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论构建的rhlR-pGEX4T-1重组质粒能够在大肠杆菌BL21(DE3)中成功地表达出具有生物学活性的RhlR蛋白。重组蛋白对小鼠表现出一定的保护作用。

穿心莲内酯对铜绿假单胞菌PAO1生物被膜形成的影响及对lasR/rhlR表达的调控机制

目的:研究穿心莲内酯对铜绿假单胞菌PAO1生物被膜(BF)形成的影响及对群体感应系统(QS)相关基因lasR/rhlR mRNA表达的调控作用。方法:利用扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)直接观察在不同浓度穿心莲内酯(3μg/ml和30μg/ml)作用下,培养72 h的PAO1 BF的生长状态;采用结晶紫定量测定法定量检测穿心莲内酯在300、250、200、150、100、50、25、15、10、5μg/ml剂量下,对72 h内PAO1形成BF厚度的影响;采用实时定量荧光PCR(Real-Time PCR)法考察穿心莲内酯对PAO1 BF形成相关基因lasR/rhlR mRNA表达的影响。结果:空白对照组PAO1在培养72 h后可形成分化成熟、较厚、密布有孔状通道,并在PAO1菌体周围呈团块、形态似"塔状"或"蘑菇状"的不规则BF结构,穿心莲内酯低剂量(3μg/ml)下,BF明显稀薄且平整,高剂量(30μg/ml)下,PAO1分散附着,均未见明显的BF结构。穿心莲内酯在300、250、200、150、100、50、25、20、10、5μg/ml剂量下,72 h内均可影响PAO1 BF的生长,在20μg/ml以上剂量,12、24、36、48、60、72 h时BF厚度明显变薄。与空白组比较,穿心莲内酯在37.5、75μg/ml剂量下均可下调lasR和rhlR基因mRNA的表达。结论:穿心莲内酯可以抑制PAO1 BF形成,该作用机制与下调细菌QS系统中lasR/rhlR基因mRNA表达相关。

铜绿假单胞菌RhlR抗血清制备

目的在原核系统中表达铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)PAO1的调控蛋白RhlR,制备兔抗RhlR抗血清。方法构建重组表达载体pGEX-4T-1-rhlR和pET-22b-rhlR并转化至大肠埃希菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达GST-RhlR和His-RhlR蛋白,经GST或Ni^(2+)亲和层析纯化重组蛋白。将His-RhlR蛋白免疫新西兰大白兔,制备RhlR抗血清,GST-RhlR蛋白包被ELISA板,检测效价。结果构建的表达载体pGEX-4T-1-rhlR和pET-22b-rhlR经双酶切及测序鉴定证明构建正确;构建的工程菌表达的目的蛋白His-RhlR和GST-RhlR相对分子质量分别为29 000和54 000,表达量均约占菌体总蛋白的85%,纯度大于90%。制备的RhlR抗血清效价可达1∶80 000。结论获得高效价的RhlR抗血清,为PA中rhl调控系统的研究奠定基础。

穿心莲内酯的协同抗菌作用及相关机制研究

目的:研究穿心莲内酯对左氧氟沙星抗铜绿假单胞菌的协同抗菌作用及相关机制研究。方法:用铜绿假单胞菌PAO1复制小鼠腹腔菌感染模型,考察穿心莲内酯对左氧氟沙星的协同抗菌作用;利用实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)技术考察穿心莲内酯在100μg/ml、1μg/ml、0.01μg/ml剂量下对铜绿假单胞菌PAO1群体感应系统(QS)系统中lasR、rhlR和pvd Q基因mRNA在24h内表达量的影响,分析药物协同抗菌作用的机制;考察穿心莲内酯在100μg/ml、1μg/ml、0.01μg/ml剂量下对PAO1胞内总蛋白和己糖激酶(HK)活性的影响作用。结果:体内抗感染保护性实验显示,左氧氟沙星和穿心莲内酯配比中剂量组(1∶0.1587)和低剂量组(1∶0.0373),感染动物24h^72h死亡率明显降低,作用明显优于单用左氧氟沙星,提示其保护性作用明显加强;Real-Time PCR实验结果显示,穿心莲内酯不同剂量对PAO1 lasR、rhlR和pvd Q基因mRNA的表达均呈现相似的先抑制后加强再抑制的动态调控趋势;在各剂量穿心莲内酯影响下,PAO1胞内总蛋白量未见明显变化,但己糖激酶活力降低明显,各剂量组与空白组比较均存在明显差异。结论:穿心莲内酯对左氧氟沙星呈现体内的协同抗铜绿假单胞菌作用,而且对PAO1 QS系统相关基因存在规律性调控,同时这一调节作用可能与降低细菌胞内己糖激酶活性存在关联。

铜绿假单胞菌群体感应系统las/rhl蛋白的研制现状

铜绿假单胞菌是一种广泛存在于环境中的革兰阴性条件致病菌,常导致免疫功能受损患者的难治性感染,针对铜绿假单胞菌群体感应系统开发新的感染防治途径是目前的研究热点之一。本文对铜绿假单胞菌群体感应系统las/rhl蛋白的研制现状进行综述。