大黄肝毒性的精确亚细胞器靶向分析

[目的]药物性肝损伤(DILI)是急性肝功能衰竭的主要原因,对人类健康构成重大挑战。大黄(Rheumofficinale Baill,Da Huang)因其具有清热利尿的作用已应用于临床。然而,它对肝脏不同细胞器的毒性作用需要进一步验证。[方法]分析大黄肝毒性的潜在靶点及其与微粒体、线粒体、内质网(ER)、高尔基体(GA)和溶酶体等五种主要细胞器的潜在损伤关系。通过整合传统中药(ITCM)数据库、HERB数据库和网络药理学,我们分离和纯化了不同的细胞器,将它们与大黄的不同组分和单体在三磷酸腺苷(ATP)培养系统中孵育,并使用粒度分析和分子生物学实验检查了细胞器的结构和功能变化,以评估大黄是否会对肝脏主要细胞器造成损伤。[结果]通过虚拟预测和实验验证相结合,我们的研究证实,从大黄蒽醌中分离的大黄素、大黄鞣质中的儿茶素和大黄有机酸中的棕榈酸对代表性细胞器造成了最显著的功能和结构损伤。在所有单体化合物中,大黄素对微粒体、线粒体、内质网和溶酶体的损伤最大;儿茶素诱导微粒体和GA损伤;棕榈酸对肝脏微粒体和GA的损伤最大。表明大黄成分可能通过多细胞器损伤发挥肝毒性。[结论]我们的研究结果表明,大黄对不同的细胞器具有不同程度的损伤作用,进而通过损害细胞器的形态和功能来影响细胞的生命活动。本研究为大黄毒性成分和靶点的精细分析提供了理论依据和技术支持。

HPLC法测定骨伤跌打康复凝胶贴膏剂中7种成分含量

目的 建立测定骨伤跌打康复凝胶贴膏剂中7种主要成分质量分数的HPLC法。方法 色谱柱为Agilent ZORBA×SB-C18S tableBond Analytical柱(4.6 mm×250 mm, 5μm);测定波长为290 nm,流动相为乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脱;流速为1.0 mL/min;柱温为35℃;进样量为10μL。结果 骨伤跌打康复凝胶贴膏剂中的原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、盐酸小檗碱、大黄酸、大黄素、大黄酚7种主要有效成分在浓度线性范围内与色谱峰面积的标准曲线线性关系良好;原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、盐酸小檗碱、大黄酸、大黄素、大黄酚的平均回收率分别为93.79%、95.86%、96.12%、95.31%、96.58%、107.43%、97.12%,7种成分的平均回收率均在93.79%~107.43%范围内。结论 建立的方法适合作为骨伤跌打康复凝胶贴膏剂质量控制的方法。

茵陈-大黄不同配比对绿原酸和蒽醌类成分的影响

为了研究茵陈-大黄不同配比对绿原酸和蒽醌类成分的影响,筛选出二者最佳配伍比例,为开发含有“茵陈-大黄”的新药提供有效的参考依据。试验选用茵陈和大黄1∶1、1∶2和2∶1三个不同配伍比例,再按照大黄同时下、后下进行煎煮;选取部分水煎液分别按照醇沉浓度为70%和80%水煎醇沉方法制备绿原酸和蒽醌类成分,采用HPLC法测定水煎液、醇沉浓度分别为70%与80%的上清液、沉淀中绿原酸及蒽醌类成分的含量。结果显示:茵陈、大黄配伍后绿原酸的含量均有所提高,且水煎法与水煎醇沉法的最佳配伍比例均为1∶1,提取出绿原酸含量为55.96 mg/mL;茵陈、大黄配伍后蒽醌类成分含量也有所提高,其中大黄酸含量提高最为显著,提取出大黄酸含量为20.83 mg/mL,且水煎法与水煎醇沉法的最佳配伍比例均为1∶2。茵陈、大黄配伍后绿原酸含量在配伍比例1∶1、蒽醌类成分在配伍比例1∶2时含量有所提高。

基于胆汁酸代谢组学探讨复方大黄煎剂保留灌肠对轻微型肝性脑病大鼠模型的治疗作用

目的 观察大黄煎剂保留灌肠对轻微型肝性脑病(MHE)大鼠模型的治疗作用,并基于胆汁酸(BA)代谢组学探讨其作用机制。方法 将55只雄性SD大鼠随机分为空白组(NC组,n=10)、肝性脑病组(HE组,n=15)、轻微型肝性脑病组(MHE组,n=15)和MHE大黄煎剂治疗组(MHEY组,n=15)。腹腔注射CCl4和硫代乙酰胺(TAA)诱导MHE、HE大鼠模型,给药2周后处死。检测血清AST、ALT、ALP、TBil、总胆汁酸(TBA)和血氨的含量;取结肠内容物检测pH值;取肝组织和脑组织进行HE染色观察大鼠肝组织病理形态学改变;取胆汁用LC-MS进行BA靶向代谢组学分析。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果 与NC组比较,HE组、MHE组寻台潜伏期(造模后、用药后)显著增加,穿台次数显著减少(P值均<0.05);与MHE组相比,MHEY组寻台潜伏期(用药后)显著降低而穿台次数显著增加,HE组寻台潜伏期显著增加而穿台次数显著减少(P值均<0.05)。与NC组比较,HE组和MHE组AST、ALT、ALP、TBil、TBA、血氨及结肠pH值显著增加(P值均<0.05);与MHE组相比,MHEY组AST、ALT、ALP、TBil、TBA及血氨及结肠pH值减少(P值均<0.05),HE组AST、ALT、ALP、TBil、TBA、血氨及结肠pH值增加(P值均<0.05)。MHE组TBA、初级BA和次级BA均低于NC组(P值均<0.05);HE组TBA和初级BA低于MHE组(P值均<0.05);MHEY组TBA、初级BA高于MHE组(P值均<0.05)。MHE组与NC组对比,GCDCA、GUDCA、GHDCA、TCDCA、TUDCA、GLCA和TLCA减少(P值均<0.05),γ-MCA、THCA、7-KDCA、AlloLCA、α-MCA增加(P值均<0.05)。MHEY组与MHE组对比,THDCA、TMCA、TCDCA、TUDCA和TLCA增加(P值均<0.05)。结论 大黄煎剂保留灌肠可通过调节BA肠-肝循环改善CCl4和TAA诱导的MHE大鼠模型肝损伤和认知功能,其作用机制可能与牛磺酸结合BA合成增加有关。

氯化胆碱基低共熔萃取剂在大黄5种游离蒽醌类成分测定中的应用

以大黄药材中的主要化学组分5种蒽醌类化合物为研究对象,制备了4种氯化胆碱类低共熔性溶剂,用涡旋方法筛选出最佳的低共熔性溶剂来提取游离态蒽醌类化合物。考察了低共熔溶剂的种类、摩尔比、含水量及涡旋时间等因素对游离态蒽醌类化合物萃取量的影响。确定最佳的提取参数为氯化胆碱/三乙二醇(摩尔比1:1)作为提取溶剂,提取时间9 min,含水量为12.5%。在此条件下,芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚的平均萃取量分别达到2.53±0.16 mg/g,4.67±0.23 mg/g,2.34±0.15 mg/g,5.91±0.28 mg/g和2.79±0.16 mg/g。与药典方法测定相比,提取效率更优。采用已经优化的提取条件对大黄10个批次的样品分析,5种游离蒽醌类化合物能实现基线分离,且分离度良好。

小檗碱和大黄酸对LPS诱导巨噬细胞炎症反应及TLR2/NF-κB信号通路的影响

目的观察小檗碱和大黄酸对脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞炎症反应及炎性相关信号通路Toll样受体2(TLR2)/核转录因子κB(NF-κB)的影响。方法将巨噬细胞RAW264. 7随机分为4组,空白组以完全培养基常规培养,LPS诱导组加入10 ng/m L LPS诱导4 h,小檗碱组和大黄酸组分别用20μmol/L小檗碱和30μmol/L大黄酸预处理2 h后加入10 ng/m L LPS诱导4 h。ELISA法检测细胞上清液炎性因子IL-1β、IL-6水平,RT-qPCR和Western blotting法分别检测细胞中的TLR2、白细胞介素4受体相关激酶(IRAK4)、NF-κΒp65 mRNA和蛋白。结果与空白组比较,LPS诱导组、小檗碱组和大黄酸组细胞上清液IL-1β、IL-6水平升高(P均<0. 05),细胞中TLR2、IRAK4及NF-κΒp65 mRNA和蛋白表达增加(P均<0. 05);与LPS诱导组比较,小檗碱组和大黄酸组细胞上清液IL-1β、IL-6水平降低(P均<0. 05),细胞中TLR2、NF-κΒp65 mRNA和蛋白及IRAK4 mRNA表达下降(P均<0. 05),小檗碱组IRAK4蛋白表达下降(P <0. 05)。结论小檗碱和大黄酸可通过下调TLR2/NF-κB信号通路分子的表达,从而抑制LPS诱导巨噬细胞炎性因子的产生和释放,以发挥其抗炎作用。

大黄酸肠溶缓释微丸的制备及体外释放度考察

目的通过对制备微丸中各种影响因素的考察以及对其体外释放度的考察和筛选,制备释药行为理想的大黄酸肠溶缓释微丸。方法采用滴制法制备大黄酸肠溶缓释微丸,考察滴速、滴距、滴管直径、干燥温度和干燥时间对微丸成型性的影响;考察海藻酸钠浓度、氯化钙浓度、氯化钙pH值以及投药量等主要影响因素对微丸体外释放度的影响。结果自制微丸光滑,圆整度好,且载药均匀,载药率在96%以上;其在人工胃液中2 h的释放度<5%;在PBS(pH 6.8)中,释放曲线表明微丸具有明显的缓释特征。结论大黄酸肠溶缓释微丸具有良好的体外缓释效果,制备工艺简单,重现性良好,且质量稳定可靠。

大黄对尿酸性肾病大鼠肾脏CTGF和HGF的影响

目的:观察大黄对尿酸性肾病大鼠肾组织中结缔组织生长因子(CTGF)和肝细胞生长因子(HGF)表达的影响,为尿酸性肾病的防治提供依据。方法:采用酵母、腺嘌呤制作尿酸性肾病大鼠模型,给予治疗后心脏采血检测肾功能,同时处死动物,取肾组织,在光镜下观察肾组织的病理改变,并应用免疫组化技术检测大鼠肾组织CTGF和HGF的表达情况。结果:(1)与正常对照组比较,模型组尿酸性肾病大鼠血清BUN、Scr、UA均明显升高(P<0.05);(2)大黄组、别嘌呤醇组大鼠血清中BUN、Scr、UA较模型组均明显降低(P<0.05),大黄组血清BUN、Scr、UA水平与别嘌呤醇组比较,差异无统计学意义(P>0.05);(3)光镜下正常大鼠肾组织结构正常,无尿酸盐结晶;模型组肾小管扩张,肾小管可见棕褐色尿酸盐结晶沉积,伴大量炎性细胞浸润,可见局灶性纤维化;大黄组、别嘌呤醇组尿酸盐结晶、炎性细胞浸润均明显减少,肾小管扩张和间质纤维化均有所改善。(4)与模型组比较,大黄组、别嘌呤醇组肾组织中CTGF的表达明显降低(P<0.01),但大黄组、别嘌呤醇组之间CTGF的表达差异无统计学意义(P>0.05)。(5)与模型组比较,大黄组、别嘌呤醇组肾组织中HGF的表达明显升高(P<0.01),但大黄组、别嘌呤醇组之间HGF的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:大黄能降低尿酸性肾病大鼠血清中BUN、Scr、UA的含量,能减少尿酸盐在肾小管中沉积及炎性细胞浸润;降低CTGF在尿酸性肾病大鼠肾组织中的表达,升高HGF在尿酸性肾病大鼠肾组织中的表达,从而减轻肾脏纤维化等损害,达到保护肾功能的目的。

大黄甘草汤中甘草酸对蒽醌类化合物提取率的影响

目的研究大黄甘草汤中甘草酸对大黄中游离与结合蒽醌类化合物提取率的影响,揭示甘草在中药方剂配伍中能缓和大黄泻下作用的原因。方法按传统水煎法制备大黄甘草汤,分光光度法测定提取液中游离与结合蒽醌类化合物的含量。结果大黄与甘草在水煎过程中,甘草中的甘草酸可增加大黄中游离蒽醌的提取率,降低大黄中结合蒽醌的提取率。结论大黄与甘草在煎煮过程中,甘草中的甘草酸与产生泻下作用的结合蒽醌生成沉淀,降低了结合蒽醌的含量,甘草可缓和大黄的泻下作用。

HPLC法测定微米大黄炭中没食子酸的含量

目的:建立HPLC法测定微米大黄炭中没食子酸含量。方法:采用Fortis universil C_(18)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相为甲醇:0.1%磷酸溶液(12:88);检测波长:273 nm;流速:0.9 ml·min^(-1)。结果:没食子酸回归方程为Y=31.93X+2.61(r=0.999 9),其浓度线性范围6.6~66.0μg·ml^(-1)。平均回收率为101.35%,RSD=1.16%(n=6)。结论:测定方法简便、准确、重复性好,可用于微米大黄炭中没食子酸的含量测定。

大黄鞣质对实验动物减体重生理机制的研究

目的 :研究大黄主要成分之一“大黄鞣质”在大黄减体重生理机制中的作用。方法 :胃饲去鞣质大黄水浸煎剂和腹腔、静脉给予没食子酸 (Gallic acid) ,观察对大鼠体重、摄食量、胃排空速度以及胰酶、肝胆汁分泌量的影响。结果 :去鞣质大黄可使肝胆汁分泌量增加 (P<0 .0 5 ) ,但对大鼠胰酶分泌量没有作用 (与对照组相比 P>0 .0 5 )。Gallic acid腹腔、静脉给药均引起大鼠胰酶分泌量降低 (与对照组相比 P<0 .0 1 ) ,但肝胆汁分泌量与对照组相比没有变化 (P>0 .0 5 )。结论 :减体重作用与胃的排空抑制。

淡盐水制大黄的两种炮制方法的研究

目的 :研究两种不同炮制方法对淡盐制大黄的影响。方法 :用紫外分光光度法测定蒽醌类成分、高效液相测定没食子酸的含量。结果 :两种方法对淡盐水制大黄影响不大。结论

高效液相色谱法测定大黄酸的含量

建立了测定大黄酸含量的高效液相色谱方法。分析柱为Waterssy Tnmetry C18色谱柱（150min×4·6mm，5μm），流动相为甲醇-水-冰乙酸（70：30：2，体积比），流速0．8mL·min^-1。检测波长为254nm，回收率为99．4%-100．2％，用于原料（掌叶大黄）和产品（大黄酸）的质量控制，同一天对大黄酸标准溶液连续测定和每隔1h进样一次测定（n=6）的相对标准偏差为0．6%～0.8％。经测定原料（掌叶大黄）中大黄酸的质量分数为0．58％，产品中大黄酸的质量分数为73．1％～90．4％。

HPLC法同时测定大黄炭中没食子酸和5-羟甲基糠醛的含量

目的:建立一种同时测定大黄炭中没食子酸和5-羟甲基糠醛含量的方法。方法:采用HPLC法,色谱柱:Agilent Zorbax ODS C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相:甲醇-0.1%磷酸溶液(8∶92),流速:0.8 ml·min^-1,柱温:25℃,检测波长273 nm。结果:没食子酸、5-羟甲基糠醛分别在5.48~54.84μg·ml^-1(r=0.999 8)、6.96~69.58μg·ml^-1(r=0.999 8)浓度范围内线性关系良好,平均回收率分别为101.54%(RSD=0.48%)、102.79%(RSD=1.07%)(n=6)。5-羟甲基糠醛含量在大黄饮片炮制20 min达到峰值,和中药专家传统"炒炭存性"经验判断的时间节点一致。结论:该方法简便、灵敏度高、重复性好,能同时测定大黄炭中2种关键成分的含量,是用于大黄炭饮片质量控制的一种可靠方法。

大黄利胆胶囊对熊去氧胆酸经治的原发性胆汁性胆管炎患者的临床观察

目的:观察大黄利胆胶囊对熊去氧胆酸(UDCA)经治的原发性胆汁性胆管炎患者的治疗效果。方法:经6个月UDCA治疗后以爱媛标准判断疗效不佳的患者60例,随机分为观察组33例,加用大黄利胆胶囊;对照组27例患者继续使用UDCA。6个月后复查患者肝功能及免疫球蛋白指标,按巴塞罗那标准判断UDCA疗效。结果:口服UDCA 1年后,观察组患者γ-谷氨酰转移酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)较6个月时明显下降,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);观察组患者UDCA应答率为63.6%,显著高于对照的37.0%。结论:以爱媛标准判断UDCA疗效不佳患者联合应用大黄利胆胶囊,可提高患者UDCA的应答率。

大黄防治实验性胃粘膜损伤机理分析

本工作通过观察测定胃酸分泌,胃排空运动和胃壁粘液分泌的变化,初步探讨了中药大黄水浸煎剂对乙醇和消炎痛造成胃粘膜损伤的防治机理。结果表明:中药大黄可抑制胃排空速度,促进胃壁粘液分泌,并能预防乙醇和消炎痛造成的胃粘膜损伤,治疗乙醇造成的胃粘膜损伤。提示:中药大黄防治胃粘膜损伤机理与抑制胃酸分泌、抑制胃排空和促进胃壁粘液分泌有关。

利用高速逆流色谱分离大黄活性成分

利用高速逆流色谱,采用加入酸碱的方法对传统中药大黄中的蒽醌类活性成分进行了分离研究.采用三氟乙酸做为保留酸,氨水作为洗脱碱,溶剂系统为正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(体积比为9∶1∶5∶5).对于分离产物做高效液相色谱分析,证明得到了大黄蒽醌的五种纯物质.

大黄栓制剂对两种溃疡性结肠炎模型小鼠的作用研究

目的:构建2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)和恶唑酮(oxazolone,OXZ)诱导的小鼠溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)模型,观察大黄栓剂对UC的治疗作用。方法:将420只昆明小鼠(♂)随机分为2组(n=210)制备小鼠TNBS和OXZ模型。Ⅰ组(TNBS模型组)将昆明小鼠(♂)随机分为7组(n=30):A(TNBS模型组)、B(柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine,SASP)栓剂组)、C(大黄800 mg·kg-1栓剂组)、D(大黄400 mg·kg-1栓剂组)、E(大黄200 mg·kg-1栓剂组)、F(空白栓剂组)、G(TNBS溶剂对照组)。Ⅰ组(A^E):0.6%TNBS溶液0.1 m L灌肠;Ⅰ组(F):不做任何处理;Ⅰ组(G):50%乙醇0.1 m L灌肠;以上7组自灌肠一次后在d 1、d 2、d 3、d 5、d 7每组处死6只。Ⅱ组(OXZ模型组)将昆明小鼠(♂)随机分为7组(n=30):A(OXZ模型组)、B(SASP栓剂组)、C(大黄800 mg·kg-1栓剂组)、D(大黄400 mg·kg-1栓剂组)、E(大黄200 mg·kg-1栓剂组)、F(空白栓剂组)、G(OXZ溶剂对照组)。Ⅱ组(A^E):皮肤涂抹1%OXZ溶液(100%乙醇溶解)0.1 m L每天一次,连续2 d(致敏),d 7以0.5%OXZ(50%乙醇溶解)0.1 m L灌肠;Ⅱ组(F):不做任何处理;Ⅱ组(G):皮肤涂抹100%乙醇0.1 m L,每天一次,连续2 d,d 7以50%乙醇0.1 m L灌肠;以上7组灌肠给药一次后在d 1~5每天处死6只小鼠。观察Ⅰ组,Ⅱ组小鼠疾病活动指数(disease activity index,DAI)、结肠组织大体损伤指数(colon macroscopic damage index,CMDI)和病理组织学评分(histopathological score,HPS),并检测小鼠结肠组织中髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的水平。结果:Ⅰ组(A)小鼠的DAI、CMDI、HPS、MPO酶活性、IL-4含量、TNF-α表达含量与Ⅰ组(G)比较在d 1、d 2、d 3、d 5、d 7均有明显改变;Ⅰ组给予含药栓剂组(B^E)与Ⅰ组空白栓剂组(F)相比,小鼠的DAI、CMDI、HPS、MPO酶活性、IL-4含量、TNF-α表达在d 1、d 2、d 3、d 5、d 7均有差异;Ⅰ组大黄不同剂量组(C^E)与Ⅰ组SASP栓剂组(B)相比,在d 1、d 2、d 3、d 5、d 7均有变化,其中大黄200 mg·kg-1栓剂组(E)差异较小。Ⅱ组(A)小鼠的DAI、CMDI、HPS、MPO酶活性、IL-4含量、TNF-α表达含量与Ⅱ组(G)比较在d 1~5差异均有显著性;Ⅱ组给予含药栓剂组(B^E)与Ⅱ组(F)相比在d 1~5均有变化,其中大黄给药组(C^E)差异有显著性;Ⅱ组大黄不同剂量组(C^E)与Ⅱ组SASP栓剂组(B)相比在d 1~5均有变化,其中大黄200 mg·kg-1栓剂组(E)差异较小。结论:TNBS与OXZ均能成功诱导小鼠UC模型;大黄对小鼠UC有一定的治疗作用,以大黄200 mg·kg-1剂量疗效较佳,但是不及SASP效果。

RP-HPLC法测定大黄复方喷雾剂大黄素、大黄酚的含量

目的建立HPLC法测定大黄复方喷雾剂中大黄素、大黄酚含量的方法。方法采用ODS柱,以甲醇-水(87∶13)为流动相,检测波长为254nm,流速为0.65mL/min。结果加样回收试验显示大黄素平均回收率99.48%,RSD=1.75%(n=9);大黄酚平均回收率101.46%,RSD=2.85%(n=9)。结论该方法简便,分离完全,结果可靠,适用于该制剂的质量控制。

三黄降糖片及其主要成分对羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶的抑制作用

目的:研究三黄降糖片及其主要成分对羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-Co A)还原酶的抑制作用。方法:在反应体系为70 mmol/L磷酸盐缓冲液、200 mmol/L NADPH、5μg HMG-Co A还原酶、2 mmol/L EDTA、2 mmol/L半胱胺、0.06%BSA中,加入浓度1、5、25、125μg/m L的三黄降糖片,三黄降糖片的主要成分大黄的水煎液和HMG-Co A还原酶抑制剂普伐他汀,然后加入37℃预热的HMG-Co A(0.6μg/m L)启动反应,检测在340 nm中反应前后其酶的即时活力、15 min内其酶的活力变化和NAPDH下降率。结果:HMG-Co A还原酶抑制作用强弱为普伐他汀>三黄降糖片>大黄水煎液,三种药物在浓度范围内呈现剂量效应关系。与浓度0μg/m L比较,三种药物在浓度25μg/m L和浓度125μg/m L时的抑制作用显著增强(P<0.05),NADPH下降率显著增加(P<0.05),而浓度为125μg/m L时,抑制作用会随时间延长而有所降低,浓度为25μg/m L时抑制作用变化不大。结论:三黄降糖片及其主要成分对HMG-Co A还原酶有一定的抑制作用,是其降脂的作用机制之一。