抗HPV11/E2基因Ribozyme对靶RNA的体外剪切研究

为了寻找HPV11型引起的生殖系统感染的治疗途径和探讨HPV的致病机理 ,本实验以HPV11病毒质粒为模板 ,扩增出HPVll型E2区 6 44bp片段 ,采用pGEM T EasyVector为载体 ,构建 pTV 6 44克隆载体 ,经筛选得到克隆株 ,提取质粒测序鉴定。采用上海生化所陈农安教授编制的锤头状Ribozyme设计软件进行计算机分析 ,选择Ribozyme对靶基因的最佳剪切位点 ,及进行基因同源性分析和生物学功能分析 ,选择出针对HPVllE2靶基因的RZ2 777,在最适条件下进行体外剪切反应 ,发现人工合成和体外转录得到的Ribozyme分子均能在相应位点准确切割靶RNA分子 ,选择合适的反应条件切割效率达到 6 0 %以上 ,Km和Kcat值分别为 0 .6 3μmol/L、0 .12 μmol/L ,RibozymeL两端的 5′ cis ribozyme和 3′ cis ribozyme自我剪切释放并未影响切割活性 ,但靶RNA侧翼序列影响了Ribozyme的剪切活性。实验研究表明 ,Ribozyme可能成为治疗HPVll型引起的尖锐湿疣的有效手段 ,并有望在分子水平上开辟出基因治疗HPVll病毒感染的另一新天地。

抗HPV11 E2核酶的计算机设计

借助计算机软件分析 ,设计出能特异性切割HPV11型 6 4 4ntE2mRNA的核酶 (ribozyme) .遵循Symon′s锤头状核酶结构和GUX剪切位点原则 ,靶序列存在 32个这样的剪切位点 .通过计算机软件分析出核酶的最佳剪切位点 ,并对底物及核酶的二级结构进行预测及进行相应基因生物学功能和基因同源性分析 ,筛选出 2个锤头结构核酶 .针对这两位点设计的核酶分别命名为RZ2 777和RZ32 81.计算机分析显示 ,两核酶与底物切点两翼碱基形成锤头状结构 ,切点所在基因序列具有相对松弛的二级结构 ,位于该基因重要生物功能区内 ,是核酶的理想攻击区域 .通过基因库检索 ,在已知人类基因排除了与上述两核酶切点两翼碱基有基因同源性序列的可能性 .将两核酶用于体外剪切实验取得了良好的实验结果 。