rRTA:DS27,ricin:DS27两种免疫毒素的初步比较

目的:用重组的蓖麻毒素A链与抗CD5的单克隆抗体DS27交联为免疫毒素rTRA:DS27,与完整蓖麻毒素制备的ricin:DS27进行对比研究.方法:分析它们对靶细胞的特异性杀伤,对骨髓造血细胞增殖的影响,内化情况,以及NH_4cl对rRTA:DS27毒性的增强作用.结果:rRTA:DS27具有更好的导向特异性,对骨髓造血功能影响较小,NH_4cl能明显增强rRTA:DS27的毒性.结论:rTRA:DS27免疫毒素具有更多的优点.

蓖麻毒素A链突变体的设计、表达与活性研究

利用蛋白质结构同源模建并结合表观静电势分析，设计了拟具有生物学活性的蓖麻毒素Ａ链的突变体．将ＰＣＲ扩增的突变体基因，导入ｐＫＫ２２３３载体中，于大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中获得高效、可溶性表达，而且。

蓖麻毒素诱导的小鼠淋巴细胞的凋亡

无菌制备小鼠脾淋巴细胞,以不同浓度蓖麻毒素(0、0.3、3、30、300μg/mL)对细胞进行处理,于不同时间段(3、6、122、4 h)采用MTS法对细胞活力进行检测。结果表明,蓖麻毒素对淋巴细胞有明显的毒性作用,3μg/mL的毒素处理细胞24 h后,细胞活力降为60%左右。为研究蓖麻毒素是否是通过诱发凋亡作用而引起细胞死亡,本试验对典型的凋亡特征进行了检测,首先用流式细胞仪对细胞的线粒体膜电位进行了检测,证明经毒素处理细胞后,其电位发生显著变化(P<0.05);Ho-echst33258染色和DNA梯度裂解检测结果同时也证明,接毒细胞发生了明显的调亡作用。此结果可为深入研究蓖麻毒素的毒理作用机制提供理论依据。

rRTA:DS27免疫毒素的制备及胞内运输研究

目的：探讨免疫毒素ｒＲＴＡ：ＤＳ２７的内化行为。方法：用原核系统来获得重组蓖麻毒素Ａ链（ｒＲＴＡ）；用胶体金双标记法进行Ｍｏｌｔ４细胞中免疫毒素的导向研究。结果：ＣＭＳｅｐｈｏｒｏｓｅ一步纯化到电泳纯的ｒＲＴＡ，电镜观察到ｒＲＴＡ：ＤＳ２７遵循特异的胞内运输途径。结论：上述结果对于深入了解免疫毒素的作用机理，并进而改善其临床应用具有重要作用。

一种纯化蓖麻毒素的新方法

该文介绍了一种新的提取、纯化蓖麻毒素的方法,首次将p-苯胺基-1-巯基-β-D-吡喃半乳糖苷(p-aminobenzyl-1-thoi-β-D-galactopyranoside)琼脂糖凝胶作为亲和层析介质,结合凝胶层析介质Sephcaryl S-200,通过两步层析纯化,获得了高纯度的蓖麻毒素。MALDI-TOF测得分子量为62925,LD50为12.4μg/kg。该方法可以制备高纯度蓖麻毒素。

蓖麻毒素A链突变体(MRTA)的分子设计

利用同源模建的方法，借助分子力学优化、分子动力学模拟退火设计构建了删除部分氨基酸序列的蓖麻毒素Ａ链突变体（ＭＲＴＡ）。采用泊松—玻尔兹曼方程对比分析了蓖麻毒素Ａ链（ＲＴＡ）与ＭＲＴＡ表观静电势分布，研究ＲＴＡ与ＭＲＴＡ蛋白表面静电性质；通过半经验量子化学ＡＭ１与分子力学结合方法探讨ＲＴＡ与ＭＲＴＡ功能域氨基酸前线分子轨道性质、能级分布。

基于蓖麻毒素B链的新型黏膜免疫佐剂设计及靶向效果初步评价

目的:利用自主知识产权抗体3E1,确定RTB与细胞特异性结合的活性肽部位,基因工程合成后,动物实验评价绿色荧光蛋白在基于RTB活性肽靶向下在体内的分布,为后续研究奠定基础。方法:用生物信息学技术,确定RTB与细胞特异性结合的活性肽部位;分子克隆技术构建含不同肽的绿色荧光蛋白原核表达载体,实现肽-GFP融合蛋白在大肠杆菌中的高效、可溶性表达;动物实验评价小鼠舌下口服肽-GFP融合蛋白后GFP在体内的分布。结果:建立了自主知识产权单抗3E1与RTB相互作用的空间构象,判定出四个活性区域,构建了4个含不同活性肽的GFP原核表达载体,获得了高纯度蛋白;经舌下口服免疫BALB/c小鼠后,免疫组化和流式细胞术证实,P1-GFP免疫组GFP和CD11c在不同组织中的分布与对照组有明显区别。P1-GFP初次免疫后,GFP主要分布于空肠,再次免疫后,GFP主要集中于回肠、肠相关淋巴组织和小肠PP结;初次免疫后CD11c+细胞主要分布于肠系膜淋巴结,胃和空肠,再次免疫后肠系膜淋巴结中的CD11c+细胞不再占优势,空肠中CD11c+细胞明显增加。结论:基于RTB的活性肽P1与GFP融合蛋白口服免疫小鼠后,P1-GFP经P1肽的导向,初次和再次免疫后GFP在体内的分布不同,再次免疫后范围更广。P1的导向使GFP直接进入小肠PP结和肠系膜淋巴结两个黏膜免疫应答的主要诱导及效应部位,利于免疫应答的发生。

从大容量抗体库中筛选抗蓖麻毒蛋白抗体

目的:从天然的单链大容量噬菌体抗体库中筛选特异性的抗蓖麻毒蛋白的人源抗体。方法:将蓖麻毒蛋白固定在抗原管上,通过5轮"吸附-洗脱-扩增"过程从大容量抗体库中筛选到特异性抗体,并转染到HB2151菌中,经IPTG诱导,制备抗蓖麻毒蛋白的可溶性单链抗体。结果:经过5轮筛选,获得40个与蓖麻毒蛋白结合的阳性克隆,其中12个特异性结合的克隆,指纹分析有7种不同的可变区片段;经过基因测序,分析了可变区基因的亚群。并将其制备成可溶性的抗体。结论:利用单链大容量抗体库获得抗蓖麻毒蛋白的噬菌体抗体并且成功制备成可溶性抗体,为今后的研究和应用奠定基础。

基于RTB的新型免疫增强剂构建、表达及免疫效果评估

目的利用自主知识产权抗体3E1,确定蓖麻毒素B链与细胞特异性结合的活性肽部位,通过构建含肽的绿色荧光蛋白原核表达载体,实现含肽的绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的高效、可溶性表达,评价小鼠舌下口服含蓖麻毒素B链肽的绿色荧光蛋白后黏膜免疫应答的能力。方法用生物信息学技术,确定蓖麻毒素B链与细胞特异性结合的活性肽部位;分子克隆技术构建含不同肽的绿色荧光蛋白原核表达载体;镍金属离子鏊合柱纯化目的蛋白;间接ELISA测定小鼠舌下口服不同肽-GFP融合蛋白后各种抗体水平的变化。结果实现了含不同肽的GFP在大肠杆菌中的高效、可溶性表达,获得了纯度大于90%的肽-GFP融合蛋白。免疫小鼠后,小鼠血清中均检测到了较高水平的IgG抗体,其中的P1肽-GFP融合蛋白免疫小鼠血清中检测到了较高水平的IgG2a和IgM抗体。免疫组血清中IgG2b、IgG3、IgA水平与对照组无明显差异。结论分别用4个小分子肽-GFP融合蛋白免疫小鼠后,小鼠血清中均检测到了较高水平的IgG抗体,其中的P1肽-GFP融合蛋白免疫小鼠的血清中检测到了较高水平的IgG2a和IgM抗体,激发了Th1型免疫应答。

重组蓖麻毒素A链与几种天然单链核糖体失活蛋白的活性研究

采用ｐＥｘＳｅｃⅠ载体系统进行了蓖麻毒素Ａ链的原核表达，经ＣＭ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ一步纯化后，获得了纯度约８０％的重组蓖麻毒素Ａ链．将其与几种天然单链核糖体失活蛋白进行了超螺旋ＤＮＡ裂解研究和无细胞体系中蛋白合成抑制试验，结果表明，重组蓖麻毒素Ａ链具有类似于天然单链核糖体失活蛋白的活性。

蓖麻毒素基本生物学特性分析

[目的]对蓖麻毒素分子量、等电点和氨基酸序列等基本生物学特性进行分析。[方法]以内蒙古通辽地区所产蓖麻哲蓖2号为对象,利用毛细管电泳技术、分子生物学技术、毒性检测等免疫学技术对其毒素基本生物学特性进行检测分析。[结果]试验中所用蓖麻毒素的等电点为6.49,分子量为61.9kD,其氨基酸序列与网上公布序列相比,A链有22个位点发生变异,B链无变异;小鼠口服LD50为5.0mg/kg,腹腔注射LD50为4.6μg/kg,淋巴细胞IC50为3μg/ml。[结论]该研究为深入了解蓖麻毒素生物学性质提供依据,同时为不同产地蓖麻毒素毒性及其他性质的差异比较奠定基础。

蓖麻毒素B链蛋白多克隆抗体的制备及胶体金免疫层析快速检测法的建立

目的：结合蓖麻毒素（RT）的多克隆抗体和单克隆抗体,建立检测RT的胶体金免疫层析快速检测方法。方法：将纯化得到的重组蓖麻毒素B链蛋白（rRTB）免疫兔,获得抗血清经正辛酸-硫酸铵分步沉淀法纯化,利用间接ELISA方法鉴定抗体效价和特异性。结合抗重组蓖麻毒素A链蛋白（RTA）单克隆抗体,采用双抗体夹心法,建立检测天然RT的胶体金免疫层析技术,并对该方法进行特异性、敏感性、稳定性等评价;在奶粉、血清、土壤等材料中进行模拟添加RT检测。结果：间接ELISA法测定抗体效价为1：105,并可特异性与rRTB结合;胶体金法能在5～10 min内完成检测,多种不同的蛋白及近缘毒素检测评价显示该法特异性良好,检测灵敏性为50 ng/ml,环境样品的检测敏感性也相同。结论：利用兔抗RTB多抗和抗RTA单抗,建立了适用于现场的快速、特异检测天然蓖麻毒素的胶体金免疫层析方法。

BALB/c小鼠免疫重组蓖麻毒素B链蛋白的免疫机制研究

目的：探讨重组蓖麻毒素B链蛋白（rRTB）免疫雌性BALB/c小鼠的免疫机制。方法：雌性BALB/c小鼠分为rRTB组和PBS组,间隔14 d皮下多点注射,共4次。间接ELISA分析小鼠血清抗体效价和抗体分型,采用流式细胞仪检测脾细胞因子IFN-γ和IL-4。结果：血清IgG效价达到1∶10-7以上,且攻毒后产生二次免疫应答,与PBS对照组差别有统计学意义（P〈0.05）;IgG1达到1∶10-5以上,与PBS对照组差别有统计学意义（P〈0.05）;Ig G2a未发生明显变化。细胞因子检测结果表明IFN-γ的表达量与PBS组差异无统计学意义,而IL-4的表达量显著提高（P〈0.05）。结论：rRTB蛋白免疫可刺激小鼠产生高水平的特异性抗体和细胞因子,诱导以IgG1为主的抗体和Th2优势应答,为候选疫苗的研制奠定基础。

基于10×Genomics技术对蓖麻毒素中毒后中性粒细胞的转录组分析

目的探究中性粒细胞在蓖麻毒素(Ricin Toxin,RT)致毒过程中的作用,寻找解毒的有效策略。方法采用10×Genomics单细胞转录组测序技术对中毒小鼠外周血单个核细胞(PBMCs)进行转录组测序及分析,并通过流式细胞术测定目的细胞亚群。结果经降维聚类、差异基因、拟时序分析结果显示CD177^(-)CD121b^(+)CCRL2^(+)中性粒细胞亚群为RT致毒过程关键亚群,随后通过流式细胞术测定显示该亚群在中毒后6小时在中性粒细胞中的比例显著升高。同时利用CCRL2抗体治疗中毒小鼠其保护率达60%。结论本研究首次发现在RT中毒后中性粒CD177^(-)CD121b^(+)CCRL2^(+)细胞亚群呈现显著升高,同时CCRL2抗体能够有效保护RT中毒小鼠,为RT致毒机制研究提供新的思路,为其治疗提供新的策略。

重组蓖麻毒素A链蛋白的可溶性表达、纯化与抗原性分析

用PCR方法从克隆质粒pUC19-RTA中扩增出蓖麻毒素A(RTA)链基因,序列分析正确后, 亚克隆到原核表达质粒pET-His中,构建重组表达质粒pET-HisRTA,再转化到E.coli BL21(DE3) plysS中获得表达工程菌株BL21/pET-HisRTA。该工程菌在30℃经0.4mmol／L IPTG诱导4h后获 得可溶性表达的目的蛋白,约占菌体总蛋白的18.45％,SDS-PAGE分析显示表达的蛋白区带与 RTA相对分子量相符,约32kDa左右。表达产物经Ni-NTA亲和层析法一步纯化,蛋白纯度约达 97.53％,并可得到约18mg/L重组RTA蛋白。Western印迹和间接ELISA结果证明,重组RTA蛋 白与抗天然蓖麻毒素多抗可发生特异性的抗原抗体反应,具有良好的抗原性,这为制备RT特异 性抗体及建立RT的检测方法奠定了基础。

重组蓖麻毒素A链表达及其与天然蓖麻毒素毒性比较研究

本试验旨在制备有高生物活性的重组蓖麻毒素A链(r-RTA)并与天然蓖麻毒素(n-RT)进行毒性比较。根据NCBI公布的RTA序列合成基因片段,并将其克隆于pET-28a载体后,利用大肠杆菌进行原核表达,镍柱亲和层析纯化上清,500mmol/L咪唑溶液洗脱获得可溶性r-RTA蛋白,通过SDS-PAGE及Western blotting对其进行鉴定并用ELISA测定其免疫原性后,对r-RTA与n-RT进行动物和细胞试验毒性比较研究。结果显示,该r-RTA在上清中表达率为31.2%;每升细菌培养物纯化后可得20mg目的蛋白,纯度≥90%,大小为32ku。其免疫原性约为n-RT的1.27倍;通过获取的n-RT细胞半抑制浓度(IC50为0.01μg/mL)及动物半数致死量(LD50为(3.27±0.44)μg/kg),以相同浓度进行细胞感染和动物攻毒试验,结果显示,同等剂量下,在细胞试验中,n-RT毒力是r-RTA的2 700倍;在动物试验中,n-RT组对动物致死率为40%,r-RTA组动物无死亡。结果表明,单独RTA,在没有RTB协助下,具有一定的毒性作用,但毒力将显著降低。该结果将为开发基于RTA的蓖麻毒素疫苗提供重要数据和理论支撑。

蓖麻毒素检测技术研究进展

蓖麻毒素是从蓖麻种子的胚乳中提取的一种核糖体失活蛋白。基于其潜在的威胁,建立快速、灵敏的蓖麻毒素检测技术受到人们的高度关注。根据蓖麻毒素的理化性质、免疫原性,已经建立了免疫荧光技术、夹心免疫PCR技术、免疫胶体金标记技术、蛋白芯片技术和生物传感器技术等用于检测蓖麻毒素。

基于生物条形码结合杂交链式反应双重信号放大检测蓖麻毒素

建立了一种基于生物条形码结合杂交链式反应扩增的高灵敏、特异性检测蓖麻毒素(Ricin toxin,RT)的方法。使用RT多克隆抗体(p Ab)及条形码DNA (Barcode DNA)制备功能性金纳米探针(GNPs),通过与RT单克隆抗体(m Ab)共同识别作用,形成"m Ab-RT-pAb/Au NPs/Barcode DNA"三明治夹心结构,进一步利用条形码DNA作为引发链触发生物素标记的发卡探针进行杂交链式扩增,形成一条具有重复单元的长双链DNA。当使用辣根过氧化物酶标记链霉亲和素与长链DNA上的生物素结合后,通过鲁米诺与过氧化氢的化学发光底物发光进行测定。结果表明,本方法检测RT的线性范围为0.61 ng/m L～5.00μg/m L,检出限为0.52 ng/m L(S/N=3),本方法具有较宽的检测范围及较低的检出限,测定饮用水及脱脂牛奶样品中RT的加标回收率在83.4%～112.4%之间,相对标准偏差在2.2%～5.4%之间,表明本方法实用性良好,在食品和饮用水安全控制及防范生物恐怖袭击方面具有良好的应用前景。

蓖麻毒素气源性中毒对小鼠免疫屏障的影响

蓖麻毒素来源广、毒性强、性质稳定,可通过注射、口服、气溶胶等多种方式中毒。为进一步优化蓖麻毒素气溶胶中毒模型,探讨蓖麻毒素气溶胶粒子对气—血屏障、血—胸屏障等免疫屏障的损伤过程,以及实质性免疫器官的病理改变,利用军事医学科学院军事兽医研究所五室已经建立的气溶胶暴露系统,对小鼠进行蓖麻毒素气溶胶的暴露,并于气溶胶暴露后12,30,48 h采集小鼠气管、肺脏、胸腺、脾脏制作病理切片,观察病理变化。结果表明:蓖麻毒素气溶胶粒子能够引起间质性肺炎、脾脏及胸腺细胞变性坏死,从而验证吸入蓖麻毒素气溶胶粒子对免疫屏障的强烈损伤。

菊苣酸对蓖麻毒素活性的抑制作用研究

为了解菊苣酸对蓖麻毒素活性的抑制作用,通过硫酸铵沉淀法和亲和层析技术,纯化得到活性良好、蛋白纯度较高的蓖麻毒素活性蛋白。将菊苣酸与蓖麻毒素共孵育,通过LDH检测发现,菊苣酸可以显著抑制蓖麻毒素活性,在药物质量浓度为64 mg·L^(-1)时,LDH释放率为38%。通过动物实验,发现菊苣酸能够降低蓖麻毒素中毒引起的小鼠死亡,死亡率为50%。研究结果表明,菊苣酸通过抑制蓖麻毒素活性,降低细胞LDH释放率,降低小鼠死亡率。表明菊苣酸是一种治疗蓖麻毒素中毒的潜在天然化合物。