应用长PCR扩增蝗虫线粒体全基因组

介绍了用两对长PCR引物扩增蝗虫(Acridoidea)线粒体全基因组的方法。从NCBI的核酸数据库下载得到36种已测昆虫线粒体全基因组,选取cytochromeb(Cytb)c、ytochrome oxidase subunitⅡ(COⅡ)、cytochrome oxidase subunitⅠ(COⅠ)基因的保守区域设计两对引物。其中引物LP03和LP04从COⅠ向Cytb扩增;引物LPCytb和LPCOⅡ从Cytb向COⅡ扩增,两对引物扩增的片段之间有大约1 kb的重叠。应用这两对引物成功扩增出10种蝗虫的线粒体基因组。考虑到在设计引物过程中所选序列在其他昆虫中的保守性,它们应能在大部分昆虫线粒体基因组扩增中发挥作用。

单环刺螠线粒体基因组全序列的获得——长PCR结合鸟枪法测序

由于具有单基因所不可比拟的优势,线粒体基因组现已成为后生动物种群遗传和分子系统发育研究中一个重要的信息来源。本研究选取螠虫动物的代表物种——单环刺螠(Urechis unicinctus),详细阐述了利用长PCR方法扩增其线粒体DNA,获得约15 kb的扩增产物,进而构建shotgun文库,最终成功获得单环刺螠线粒体基因组全序列的流程。本实验流程样品需求量少、设备要求低、简便快捷。

动物线粒体基因组测序方法的研究进展

线粒体是具有独特DNA分子和完整遗传信息传递与表达系统的一类细胞器,参与能量代谢、信号转导、细胞凋亡等许多生命活动。线粒体DNA突变与线粒体疾病的发生密切相关,广泛应用于分子生物学、遗传学、法医学鉴定等各个方面。因此,线粒体基因组测序对于其结构功能的研究有重要价值。本文综述了线粒体基因组测序方法的研究进展,重点是第一代基因测序技术、聚合酶链反应(PCR)技术、第二代基因测序技术,以及滚环扩增技术和线粒体间接测序,并对每种方法的优缺点进行了总结,归纳了线粒体假基因对线粒体基因组分析过程中的干扰和处理策略。

磷虾类线粒体基因组的特征和基因排列比较

利用长PCR扩增获得太平洋磷虾的线粒体DNA,结合鸟枪法和引物步移法测定太平洋磷虾的线粒体基因组。结果表明,太平洋磷虾线粒体基因组全长为16898bp,在最大非编码区中存在一个串联重复区域(4.7×154bp)。在15个主编码基因中,变异位点数最多的是nad5基因(319～321个),其次为nad4基因(284～285个)和cox1基因(232～233个)。因此,nad5基因和nad4基因可以作为候选的分子标记,用于分析磷虾类不同的物种和群体之间的生物多样性。对比泛甲壳动物的原始排列,太平洋磷虾和南极磷虾线粒体基因组共享3个转运RNA基因(tRNALeu(CUN)、tRNALeu(UUR)和tRNATrp)的易位。与太平洋磷虾线粒体基因组相比,南极磷虾线粒体基因组存在1个转运RNA基因(tRNAAsn)的重复和1个转运RNA基因(tRNAIle)的易位。太平洋磷虾和南极磷虾之间的基因排列并不完全一致,说明在磷虾类内部线粒体基因组的基因排列顺序并不保守。

萧氏松茎象线粒体基因组全序列测定与分析

象甲是鞘翅目中物种最丰富的类群,目前关于其线粒体基因组全序列的研究还未见报道。本研究利用长距PCR和引物步移法对萧氏松茎象Hylobitelus xiaoi Zhang线粒体基因组全序列进行了测定。结果显示:萧氏松茎象线粒体基因组序列全长16123bp(GenBank登录号为JX847496),共编码37个基因和1个非编码的控制区,基因次序与典型的六足动物线粒体基因排列一致,未发现基因重排现象。在基因组中两个值得注意的发现分别是:1)N链上存在1个额外的trnV-like序列,反密码子为GAC,长度为69bp,其中65bp与J链上的trnD重叠;2)trnSUCN和nad1之间存在1个长度为232bp的基因间隔区。全部13个蛋白质编码基因的起始密码子均为ATN,9个蛋白质编码基因的终止密码子为TAA,其余4个蛋白质编码基因中,nad1和cox2的终止密码子为TAG,nad4和nad5则以不完整的终止密码子T作为终止信号。除trnSAGN外,其余的tRNAs均可形成典型的三叶草结构。而trnSAGN的反密码子由TCT替代GCT,反密码子臂延长形成9bp(中间含1个碱基突起),TΨC臂由正常的5bp变为6bp,DHU臂缩短仅1bp,各个臂之间没有连接碱基。线粒体控制区中包括10处长度不少于5bp的poly-T(最长poly-T长度为14bp)和2处微卫星样重复序列(TA)6和(TA)9。本研究结果为探讨象甲总科在鞘翅目中的系统学地位及其与其他总科间的系统发生关系等问题提供了重要的分子生物学数据。

鲢中华鳋线粒体基因组的基因组成及特征分析

研究旨在测定隶属桡足亚纲(Copepoda)杯口水蚤目(Poicilostom atoida)的寄生甲壳动物鲢中华鳋(Sinergasilus polycolpus)线粒体DNA(mtDNA)序列,分析其结构特征,为节肢动物系统进化研究积累资料。利用简并引物扩增鲢中华鳋Cytb和COI基因片断,据此设计特异性引物Long-PCR扩增鲢中华鳋mtDNA序列,拼接后得到12917bp的序列(GenBank登录号为EU621723)。这段序列A、T、C、G碱基含量分别为35.0%、35.8%、14.0%和15.2%,GC-Skew和AT-Skew值分别为0.041和-0.011。通过序列同源性和结构分析,鉴定了35个基因,包括13个蛋白编码基因、21个tRNA基因和1个12SrRNA基因,推测未能扩增到的片段包含16S rRNA、tRNAArg和tRNAThr基因以及控制区序列。tRNA基因长度在54—63bp之间,均可折叠成典型的三叶草结构,但TψC臂长度变化较大,其中有三个缺少TψC臂。35个基因中,4个蛋白质编码基因和7个tRNA基因位于N链,其余的位于J链。基因间重叠有12处,重叠碱基量达159bp。进一步研究桡足类及相关类群线粒体基因组的遗传特征将有助于揭示和阐明桡足类系统发育关系。

构建SD大鼠鱼藤酮中毒模型及其线粒体DNA突变的初步探索

目的构建SD大鼠鱼藤酮慢性中毒模型,同时对SD大鼠组织标本（脑组织和肝脏）进行线粒体DNA突变的初步探索,为后续实验提供线索。方法将75只雄性SD鼠随机分为三组,实验组：0.5 mg/（kg·d）鱼藤酮皮下注射4~8周,共45只;空白组：不予任何特殊处理4~8周,共15只;对照组：相同体积的二甲基亚砜（DMSO）皮下注射4~8周,共15只。其中实验组随机分为1、2、3小组,每小组15只;空白组和对照组也分别分为1、2、3小组,每小组5只。每组内相应的1、2、3小组分别在实验的第4、6、8周处死老鼠并留取相应的组织标本（中脑组织和肝脏）,存储于-80℃冰箱中待用。在实验组的每个小组内分别随机选取3对组织标本,共9对;在空白组和对照组的每个小组内分别随机选取1对组织标本,共6对。随后进行组织DNA提取,采用2对引物进行长PCR并将PCR产物进行凝胶电泳分析,同时设计并利用线粒体DNA引物,用一代测序的方法进行线粒体全基因组测序。实验中观察各组大鼠的一般情况并进行行为学测试。结果1）实验组大鼠在实验中表现出较为明显的中毒症状。在体重增长速度上与对照组和空白组存在明显差异（P〈0.05）。在行为学上,实验组大鼠亦表现出了较为明显的行为学异常（P〈0.05）。2）大鼠脑以及肝脏组织的长PCR凝胶电泳结果未发现明显的异常条带;所有测序突变（缺失、插入、点突变）均为大鼠固有突变。结论 0.5 mg/（kg·d）鱼藤酮皮下注射4~8周可导致SD大鼠鱼藤酮慢性中毒。SD幼鼠的选择、鱼藤酮剂量及作用时间、一代测序等多种因素可能是导致本次实验未检测到有意义的线粒体DNA突变的原因。因此,后续实验应做相应改进。

线粒体基因组测序策略和方法

本文综述了线粒体基因组测序策略和方法,在传统测序方法中介绍了基于物理分离线粒体DNA的克隆文库测序方法和基于PCR扩增产物的直接测序方法,后者重点介绍了基于长PCR扩增产物的引物步移法和基于总DNA的引物步移法;应用新一代高通量测序方法有基于总DNA样品的方法,包括需要预扩增mtDNA的多物种平行高通量和无需预扩增mtDNA的高通量方法,基于总RNA样品的转录组测序方法等。在实际工作中,选择哪种方法取决于研究规模、样品大小和保存状态、经费情况等。总的来说,基于长PCR扩增产物的引物步移法尤其适合小规模昆虫线粒体基因组研究,而对于大规模线粒体基因组研究来说,NGS技术无疑是省时省力的最佳选择。

棒花鱼(鲤形目,鲤科)全线粒体基因组测定与分析

采用长聚合酶链式反应（L-PCR），以L-PCR扩增产物为模板，用30对短PCR引物进行2次PCR（Sub—PCR）扩增，测定并注释了棒花鱼全线粒体基因组。结果表明：棒花鱼线粒体基因组全长16597bp，A＋T含量55．7％，基因组成及排列顺序与其它硬骨鱼类一致，包括13个蛋白质编码基因，22个tR-NA基因，2个rRNA基因和1个控制区（D-100p）。L链编码1个蛋白质编码基因（ND6）和8个tRNA基因（tRNA—Gin，tRNA·Ala，tRNA-Cys．tRNA-Asn，tRNA．Tyr，tRNA-Ser，tRNA-Glu，tRNA-Pro），其余基因由H链编码。棒花鱼线粒体基因排列紧密，基因间隔12处60bp，间隔长度1—31bp不等；基因重叠区7处24bp，重叠区碱基覆盖数在1—7bp之间。13个蛋白质编码基因中，除COI的起始密码子为GTG外，其余均为ATG；8个蛋白质编码基因的3’端为完全终止密码子TAG（NDl、ND2、ND6）和n认（CoI、ATP8、ATP6、ND4L、ND5），其余5个基因均为不完全终止密码子TA（ND3、ND4）和T（COⅡ、COⅢ、Cyb）。除tRNA-Ser（AGY）基因外，其余21个tRNA基因二级结构均为典型的三叶草型。控制区（D．100p）位于tRNA-Pro和tRNA—Phe基因之间，长928bp，控制区有3个结构区：终止序列区（TASs），中央保守区（GSBs）和保守序列区（CSB-1、CSB·2、CSB-3）。