牙鲆rnd1基因克隆、表达模式及与抗病力的关系

迟缓爱德华氏菌病是海水鲆鲽鱼类的主要病害,发掘抗病分子标记辅助育种是十分有效的策略。本研究以牙鲆(Paralichthys olivaceus)rnd1基因(Pornd1)为对象,对该基因在牙鲆抗病免疫方面的作用进行系统分析。首先对Pornd1基因进行克隆鉴定和抗病相关单核苷酸多态性位点的定位,然后利用荧光定量PCR(qRT-PCR)对Pornd1基因的组织分布、细菌感染后表达情况以及在抗病和易感家系中的表达水平进行检测。结果显示,Pornd1 c DNA开放阅读框为699 bp,编码232个氨基酸。结合前期GWAS分析数据,本研究对Pornd1基因扩增和测序,确定Pornd1基因内含子2上存在一个抗迟缓爱德华氏菌病相关单核苷酸多态性位点,该位点在易感家系和抗病家系中分别是C/T,抗病家系(freqT=0.92)高于易感家系(freqT=0.20),具有显著性差异(P<0.05)。Pornd1在心、肝和肾中的相对表达量较高;迟缓爱德华氏菌感染后肝、肾和脾中Pornd1的表达量在6 h降低后逐渐升高,在48 h达到最高。Pornd1在抗病家系肝脏中的表达量显著高于易感家系。在蛋白水平,利用大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统表达PoRnd1重组蛋白,检测其抑菌活性,发现PoRnd1重组蛋白对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)均具有一定抑菌活性。本研究揭示了Pornd1在牙鲆免疫抗病方面的作用,为开展牙鲆抗病分子育种提供了一个有效标记,并为解析其抗病性状的遗传机制提供理论基础。

癫痫发病中Rnd1-2蛋白的表达情况及意义

目的探讨Rnd1-2蛋白在癫痫患者脑组织中的表达情况。方法选择癫痫手术患者36例作为研究组,同时选取12例颅脑创伤患者作为对照组。应用免疫荧光、免疫组化以及Western-blot法检测2组脑组织中Rnd1-2蛋白表达情况。结果研究组颞叶脑组织中Rnd1-2蛋白的平均灰度显著低于对照组(P<0.05),阳性细胞数、光密度值均显著高于对照组(P均<0.05);免疫荧光检测显示,研究组Rnd1-2蛋白的阳性表达区域同神经元特异性烯醇化酶阳性区域基本重叠。结论 Rnd1-2蛋白表达集中于神经元,在癫痫的形成过程中有重要作用,对Rnd1-2蛋白的研究有助于阐明癫痫发病机制,有应用及推广价值。

大黄鱼 Rnd1 基因表达载体构建及表达模式分析

为探究Rnd1基因在大黄鱼免疫应答过程中的作用,采用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)对该基因的表达模式进行分析,同时构建原核表达载体pET-28a-Rnd1,并转化进大肠杆菌后诱导该蛋白的融合表达。研究结果表明:大黄鱼Rnd1基因ORF为699 bp,编码232个氨基酸;经序列多重比对和进化树构建发现,Rnd1的氨基酸序列高度保守;在健康大黄鱼的8个免疫组织中,Rnd1在肝脏中相对表达量最高,其次为脑,而在肠中表达量最低;变形假单胞菌攻毒后,Rnd1在肝脏中48 h时达到最高值,为对照组的25倍;在脾脏中则持续上调表达,尤其在48 h后升高更为明显。

RND1通过p53蛋白促进PC12细胞凋亡

目的探讨RND1对神经细胞凋亡的作用及可能的相关机制。方法利用脂质体转染质粒,建立体外高表达RND1细胞模型,具体分组为flag-RND1组和flag组;以流式细胞术、Q-PCR和免疫印迹等方法检测各组细胞内RND1、p53、cleaved-Caspase3蛋白表达及凋亡水平。结果与对照组比较,flag-RND1组RND1表达水平升高,流式细胞术显示flag-RND1组细胞凋亡水平增高,同时flag-RND1组细胞内凋亡蛋白cleaved-Caspase3的表达水平较flag组升高(P<0.05);伴随凋亡情况改变,p53蛋白表达水平降低。结论小GTP酶蛋白家族成员RND1可能通过p53蛋白参与调节神经细胞凋亡,这可能是1个新的神经元凋亡调控位点。

颞叶癫大鼠海马内Rnd1 mRNA及蛋白表达变化

目的:动态观察小分子GTPase Rho家族的Rnd1 mRNA及其蛋白在氯化锂-毛果芸香碱(匹罗卡品)致大鼠模型海马中的表达变化,探讨其在颞叶癫发生发展中的作用。方法:在氯化锂-毛果芸香碱颞叶癫模型中应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测癫持续发作(SE)后各时间点海马内Rnd1 mRNA的表达变化,并运用免疫组织化学染色法及Neo-Timm染色法分别检测齿状回门区、CA1区及CA3区中该蛋白在不同时间点的表达变化及苔藓纤维出芽(MFS)情况。结果:实验发现模型组于SE后8h内即出现Rnd1表达上调,SE后约1d达高峰,7d左右回复至对照组水平,此后其mRNA表达水平与对照组相似;而免疫组化染色发现Rnd1蛋白表达从SE后8h内即开始上调,约3d达高峰,至7d虽略有回落,但仍高于对照组水平,且这种情况可一直持续至慢性期。结论:急性期海马齿状回门区Rnd1表达上调可能通过促进MFS的发生参与了颞叶癫的发生。