roGFP1探针在玉米幼胚中响应细胞氧化还原状态改变的初步研究

[目的]建立roGFP1探针响应玉米体内氧化还原状态变化的稳定表达系统。[方法]首先利用基因枪介导玉米幼胚转化法瞬时表达roGFP1基因,利用激光共聚焦显微镜405和488 nm激发光通道对10 mmol/L H2O2和2 mmol/L DTT溶液处理下的幼胚进行510nm的GFP荧光成像,后通过ImageJ处理图像和分析荧光比值[405/488 nm];同时利用农杆菌介导玉米幼胚转化法开展roGFP1基因的玉米稳定转化,进行Southern Blot鉴定和荧光显微镜观察。[结果]在玉米幼胚瞬时表达系统中,经10 mmol/L H2O2处理后,roGFP1探针的荧光强度比值[405/488 nm]由原来的0.844升高至1.837,而在2 mmol/L DTT溶液处理下的荧光强度比值下降至0.911;经Southern Blot鉴定和GFP荧光检测获得了roGFP1转基因阳性植株。[结论]在玉米幼胚瞬时表达系统中,roGFP1探针能够响应由外源氧化还原剂引起的体内氧化还原状态改变;获得了表达roGFP1的转基因玉米植株。

流式细胞术在检测细胞氧化还原状态荧光蛋白探针中的应用

目的·探索流式细胞术检测基因编码的荧光蛋白探针ro GFP2的方法,比较其与经典的激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)检测方法的异同,探讨其在检测不同氧化还原状态细胞亚群中的应用价值。方法·用ro GFP2转染He La细胞,经H_2O_2处理后,采用LSCM技术和流式细胞术分别检测ro GFP2,以405 nm/488 nm荧光信号强度比值反映细胞氧化还原状态。转染胰腺癌细胞株Panc-1细胞,应用流式细胞术检测CD44和CD24不同标记细胞亚群的ro GFP2,比较干细胞与其他细胞氧化还原状态的异同。结果·与LSCM技术相比,流式细胞术也可检测H_2O_2引起的ro GFP2变化,且可区分群体中不同的亚群。Panc-1细胞中CD24^+/CD44^+肿瘤干细胞群与非干细胞群相比,ro GFP2比值更低,细胞处于更还原的状态。结论·流式细胞术可用于检测基因编码的氧化还原探针和特异地分析亚群的变化,可能将应用于肿瘤生物学、干细胞生物学等研究中。

基于COPAS自动分选系统检测线虫线粒体氧化还原状态(英文)

线粒体是氧化还原信号通路的重要节点,然而,对于线粒体氧化还原变化的原位检测十分困难。作者选择秀丽隐杆线虫为模式生物,使用线粒体定位的氧化还原敏感探针Grx1-roGFP2对线虫进行标记。同时,为了快速比较多个样品间的氧化还原变化,建立了基于COPAS生物自动分选系统的自动定量检测方案。结合氧化还原敏感探针标记的转基因线虫品系,该方法能够快速检测RNA干扰以及线虫生长发育不同时期引起的线粒体氧化还原变化。