Isolation and Identification of Root Rot Fungus of Astragalus membranaceus

The perennial root of Astragalus membranaceus is used as a medicine, while root rot is a main factor causing reduction of quality and commodity value of A. membranaceus . The screening and research of the pathogenic species and their characteristics could provide theoretical and practical basis for the control of this disease. A pathogenic strain was isolated and purified from the root part of four-year-old A. membranaceus , and identified by morphological and molecular biological methods as Fusarium oxysporum . This study will provide a theoretical basis for the research of the biological characteristics and control of F. oxysporum .

黄芪根腐病菌腐皮镰刀菌的实时荧光定量PCR检测方法建立

本研究成功建立了一种针对黄芪根腐病菌腐皮镰刀菌(Fusarium solani)的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测方法。该方法基于腐皮镰刀菌翻译延伸因子EF-1α基因序列,设计了特异性引物对FP.F/FP.R,并验证其特异性。建立腐皮镰刀菌的RT-qPCR检测方法;运用所建方法检测黄芪及土壤中腐皮镰刀菌的含量,验证其检测效果。结果表明:设计的引物FP.F/FP.R特异性强,RT-qPCR检测的灵敏度为0.0192 ng/μL,重复性评价显示方法稳定、可靠。应用该RT-qPCR方法,可从黄芪接种发病和疑似发病样本及土壤样本中检测出腐皮镰刀菌。结果表明,3组样本的总阳性检出率均为100%。同时,植株和土壤中腐皮镰刀菌的含量变化与根腐病的严重度基本一致。因此,本研究建立的RT-qPCR方法能够有效地用于黄芪植株及土壤中腐皮镰刀菌的定量检测,为根腐病的早期诊断、预警和病原菌的动态监测提供了重要的技术支持。

甘肃陇西黄芪根腐病病原菌的分离与鉴定

黄芪根腐病是严重影响黄芪产量的病害之一,为确定其致病的主要致病菌,本实验对采自甘肃陇西的黄芪根腐病病株以组织分离、离体根部接种、盆栽实验法进行病原菌的分离和致病性测定.结果获得了5株黄芪根腐病致病菌,并通过培养特征、显微形态及rDNA ITS序列分析综合鉴定,确定菌株G2、G3、G4为茄腐镰刀菌(Fusarium solani),G5、G6为尖孢镰刀菌(Fusarium xoysporum).

不同物质对黄芪根腐病致病菌的抑制作用

采用生物测定的方法,选择苦参碱、槐啶碱、槐果碱、对羟基苯甲酸和阿魏酸5种物质,研究各物质水和丙酮溶液以及不同物质丙酮混合溶液对黄芪根腐病2种主要致病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制活性和最低抑菌质量浓度.结果表明:不同物质对2种致病菌菌丝生长和孢子萌发的影响不同,同种物质丙酮溶液的抑菌效果明显好于水溶液的抑菌效果.3种生物碱对2种致病菌菌丝生长的抑制作用比较显著,其中槐啶碱丙酮溶液的抑菌活性最强,在质量浓度为1.00g/L时的相对抑制率分别为43.63%,27.10%,最低抑菌质量浓度均为0.0625g/L.2种酚酸类物质对2种致病菌孢子萌发的抑制作用明显强于对菌丝生长的抑制作用.不同物质丙酮混合溶液对2种致病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制活性与单个物质丙酮溶液无明显差异,抑制效果最好的槐啶碱和苦参碱混合液对2种致病菌抑制的EC50为31.62,10.00g/L,最低抑菌质量浓度均为0.0625g/L.不同物质的水和丙酮溶液对2种致病菌活性的抑制作用存在明显的浓度效应,抑制作用随溶液浓度降低而减弱.

黄芪麻口病的成因及防治技术研究

为明确黄芪麻口病的成因,在甘肃陇西县多年种植的黄芪田进行调查、采样和防治试验。通过对黄芪根腐病菌的分离鉴定及根结线虫的分离,明确了根腐病菌不是黄芪麻口病的致病菌,在供试的麻口病株上未分离到线虫。经过回接地下害虫试验,确认黄芪根瘤象(Sitona ophtalmicus Desbrochers)幼虫的取食为害,是造成黄芪麻口病发生的主要诱因,经中科院动物所专家鉴定该虫为中国新记录种。田间药剂防治试验结果显示,黄芪移栽前用5%丁硫克百威颗粒剂45kg/hm2土壤处理,用15%阿维·毒乳油30kg/hm2灌根,防治效果良好,一次灌根的防治效果达87.51%,挽回92.14%的产量损失。

山西黄芪根腐病优势病原菌鉴定及其拮抗菌的多重筛选

目的:在明确山西省黄芪根腐病优势病原菌的基础上,针对其进行拮抗菌的筛选。方法:通过组织分离法获得黄芪根腐病的致病菌,并根据柯赫氏法则进行回接证病,采用常规形态和EF-1α序列分子鉴定相结合的方法确定其分类地位;同时以优势病原菌为靶标,通过室内多重筛选的方式筛选获得生防菌株。结果:明确了腐皮镰刀菌Fusarium solani为山西黄芪根腐病的优势病原菌之一,筛选获得的拮抗菌G10对其表现出了良好的平皿拮抗和离体防病效果。结论:以Fusarium solani为靶标筛选获得的拮抗菌G10,具有开发为专用生防制剂的潜力。

黄芪根腐病病根的显微及超微结构研究

利用石蜡切片和超薄切片方法,以黄芪(Astragalus membranaceus)的健康植株作为对照,研究了黄芪根腐病病根的解剖结构、致病真菌的侵入方式以及在根内的分布,为进一步从细胞水平研究黄芪根腐病致病机理提供理论依据.结果表明:病根与健根的基本解剖结构没有明显的区别,主要差异是病根中有入侵的真菌,大量染色较深的菌丝结分布在薄壁组织细胞中;真菌侵入时不破坏周皮,其菌丝穿过周皮组织细胞进入韧皮薄壁组织,在薄壁细胞中形成菌丝结,并逐步扩展成一定的侵染区域,继而向下一层薄壁组织细胞内侵入,严重时甚至侵染到木质部.真菌的生长和增殖抑制了细胞的生长.

敦煌盐碱土中抗黄芪根腐病放线菌的筛选、鉴定及发酵条件优化

采用平板对峙法和菌丝生长速率法从盐碱土中分离筛选对黄芪根腐病有生防作用的放线菌,并对黄芪根腐病具有较好拮抗作用的菌株A12-2-11进行了初步鉴定及培养条件优化.研究结果显示,菌株A12-2-11发酵滤液抑菌率为41.77%;最适发酵培养基为蔗糖10g·L^(-1),(NH_4)_2SO_410g·L^(-1),K_2HPO_41g·L^(-1),NaCl 10g·L^(-1),CaCO_31g·L^(-1),pH 8,优化培养条件后菌株A12-2-11的抑菌率为75.02%.依据放线菌形态学、生理生化特征结合16SrDNA序列分析,初步鉴定菌株A12-2-11为黄色长孢链霉菌(Streptomyces longisporoflavus).研究结果对黄芪根腐病生物防治具有一定的应用前景.

四种植物不同溶剂浸提液对黄芪根腐病致病菌的抑制

选择黄芩、苦豆子、苦参和洋葱四种植物为研究对象,分别用蒸馏水、70%乙醇、丙酮和乙酸乙酯四种不同溶剂进行提取。通过对菌落生长实验和最低抑菌质量浓度的测定,筛选出对黄芪根腐病两种主要致病菌有较强抑制作用的四种植物不同溶剂提取液。结果表明:不同植物的抑菌效果不同,同一种植物的不同溶剂提取液抑菌效果也不同。在所选择的四种植物中,苦参的丙酮浸提液对根腐病两种主要致病菌的抑菌效果比较显著,在质量浓度为200 g/L时的抑菌率分别为61.2%,31.2%,最低抑菌质量浓度均为6.25 g/L,且它对腐皮镰孢菌抑制的EC50仅为99.3 g/L。苦参的70%乙醇浸提液对尖镰孢菌的抑制效果也达到50%以上。

芽孢杆菌R57对黄芪的防病提质作用及其鉴定

研究旨在探讨菌株R57对黄芪的抑菌防病和品质提升作用,并对其进行分类鉴定。采用牛津杯法测定无菌发酵液的体外抑菌效果、浸根法测定离体防病效果、灌根法测定盆栽防病效果;采用灌根法处理黄芪,HPLC-UV-ELSD法测定药效成分含量变化;采用形态学观察、生理生化特性测定和16S rDNA序列分析,确定菌株分类地位。体外抑菌试验结果表明,菌株R57无菌发酵液对根腐病菌F.solani和F.acuminatum的抑菌圈直径分别为(18.02±1.71)mm和(19.96±2.42)mm。离体试验中,R57治疗性处理对2种病菌引起的根腐病在7天和15天时均有显著防效,保护性处理对F.solani和F.acuminatum侵染分别在7天和15天时有明显防效,拮抗处理仅在7天时对F.solani侵染有抑制作用。盆栽试验中,R57发酵液对F.solani和F.acuminatum引起的根腐病,保护性防效分别为61.27%±4.89%和64.33%±8.25%,治疗性防效不显著。R57发酵液施用还可显著促进黄芪中主要活性成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷的积累。经鉴定,菌株R57为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),该菌株具有“防病提质”的双重功效,可作为微生物制剂的多功能菌株进一步开发研究。

黄芪根腐病生防菌株的筛选鉴定及其防效评价

以沙棘根瘤内生细菌为材料,筛选对黄芪根腐病具有生防效果的菌株,以期为黄芪根腐病的生物防治提供优质菌种。采用平板对峙法,筛选得到抑菌性能较强的沙棘根瘤内生细菌TT14,并检测其对4株黄芪根腐病原菌的抑菌活性;根据形态和培养特征,生理生化特性及16S rRNA基因序列分析,对菌株TT14进行鉴定;通过盆栽试验,测定菌株TT14发酵液对黄芪根腐病的防治效果。结果显示,25株沙棘根瘤内生细菌中,11株具有抑制黄芪根腐病的能力,其中5株对供试的4株黄芪根腐病病原菌都表现出较好的抑菌效果,在这5株内生菌中TT14抑菌效果最佳,其对4株病原菌的抑菌率均在54.52%以上;经鉴定菌株TT14为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis);盆栽试验显示菌株TT14发酵液对黄芪根腐病有明显的生防效果,其防治效果达65.68%,较对照组提高38.08%。综上可见,沙棘根瘤内生细菌TT14具有较强的抑制黄芪根腐病的活性,并具有较好的生防效果。

黄芪根腐病病株和健株根围微生物菌群变化分析

通过分析黄芪根腐病病株和健株根围微生物菌群的变化,探究根腐病的发病机理,寻找预警病害发生的生物指示因子,为土壤微生态的生物调控提供依据。试验通过菌落计数、PCR-DGGE和16S rRNA V3区基因测序的方法,分析不同年限下黄芪根围病/健土中微生物区系、多样性及群落结构的变化。结果表明:细菌作为黄芪根围土中的优势种群,是影响病土中微生物数量升高的关键因子,其多样性降低是影响病害加重的主要原因之一。假单胞菌属Pseudomonas和无色杆菌属Achromobacter为土壤中的优势菌群,健土中的1号和4号特异条带分别为未培养的假单胞菌Uncultured Pseudomonas sp.和荧光假单胞菌P.fluorescens;6号未培养假单胞菌Uncultured Pseudomonas sp.的丰度与根腐病发病率负相关,16号无色杆菌Achromobacter sp.的丰度则在3年生土壤中显著升高,随后急剧下降。上述4个菌可作为潜在的土壤健康或发病指示因子进一步研究。

根腐病对黄芪根围土壤酶活性影响的动态分析

为明确根腐病发生对黄芪根围土壤酶活性的影响,研究采集1～6年生黄芪根围发病和健康土壤,采用经典方法对4种主要土壤酶(脲酶、纤维素酶、蔗糖酶和过氧化氢酶)的活性进行测定和分析。结果表明,根腐病的发生对脲酶、纤维素酶和蔗糖酶的活性有显著影响;1～4 a间,发病土相对健康土的脲酶活性减少量、纤维素酶和蔗糖酶活性增加量均与发病率呈正相关;第5年时各酶的活性开始向健康状态恢复,第6年时酶活性继续恢复,且与该年根腐病发病率降低的情况相吻合。由此可知,黄芪根腐病的发生与土壤酶活性的变化密切相关。

拮抗芽孢杆菌对蒙古黄芪主要药效成分的影响

探讨黄芪根腐病拮抗芽孢杆菌SXKF16-1(Bacillus atrophaeu)和SXKF16-2(B. methylotrophicus)对黄芪主要药效成分的影响,旨在为后续多功能制剂的开发提供依据。采用灌根法对健康黄芪苗浇注拮抗菌发酵液,HPLC-UV-ELSD法对10种药效成分进行测定。结果表明,毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、紫檀烷苷、异黄烷苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素和黄芪皂苷Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ在各自标准曲线相应的线性范围内线性关系良好(r≥0.9950),试验测定结果可靠。拮抗芽孢杆菌SXKF16-1和SXKF16-2处理对药效成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、紫檀烷苷、异黄烷苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅳ的含量均无明显影响,但显著促进黄芪皂苷Ⅰ和黄芪皂苷Ⅲ含量的升高。2组处理与对照相比,总黄酮含量均无明显变化,总皂苷含量显著升高。拮抗芽孢杆菌SXKF16-1和SXKF16-2对黄芪主要药效成分的含量无负面影响,可促进某些皂苷类成分的积累,具备开发为多功能制剂的潜力。

黄芪根腐病生防芽孢杆菌的筛选鉴定与盆栽防效试验

黄芪根腐病是严重影响黄芪产量的病害之一,为得到对黄芪根腐病病原菌具有较强拮抗作用的芽孢杆菌,以病原菌 Fusarium solaniun KR997532 为靶标菌株,对本实验室筛选保存的植物病原菌的拮抗芽孢杆菌进行初筛和复筛,得到了 1 株具有较强拮抗作用的菌种 7-2-1-6,根据菌株 7-2-1-6 的 16S rDNA 序列分析结果,结合其培养形态特征和生理生化特性,将其鉴定为枯草芽孢杆菌亚种(Bacillus subtilis subsp. Spizizenii)。菌株 7-2-1-6 在盆栽试验中防治效果约为 68.80%,对黄芪根腐病有较好的生防效果。

根腐病菌侵染对黄芪苯丙烷途径关键酶活性的影响

以蒙古黄芪-根腐病菌(Fusarium solani和F. acuminatum)为互作体系,测定苯丙烷途径关键酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羟化酶(C4H)及4-香豆酸-辅酶A连接酶(4CL)活性的变化,以期获得黄芪抗根腐病菌侵染机制的信息,为抗病育种工作提供参考。试验采用幼苗浸根法接种病菌,分光光度法测定3种酶的动态变化。结果表明,F. solani侵染黄芪后,PAL和C4H活性与对照相比明显升高,并在7、21天出现2个酶活高峰;4CL活性则随着时间的延长持续上升,7、21天时也显著高于对照。F.acuminatum侵染黄芪后,PAL、C4H和4CL的活性均在21天显著高于对照。可见2种病原菌在侵染黄芪过程中,苯丙烷途径的关键酶被不同程度地激活,但2种病菌激活各酶的时间和规律有所差异,表明黄芪对这2种病菌的抗性机制明显不同。

黄芪根腐病病原菌的分离鉴定及对其抑制作用分析

黄芪(Astragalus membranaceus)是膜荚黄芪和蒙古黄芪的干燥根,根部受病原菌侵染会导致根腐病发生,根腐病会严重影响黄芪的药用价值及其产业的发展。黄酮和皂苷类物质属于黄芪的次级代谢物,也是黄芪的主要药用成分。为了明确黄芪根腐病致病菌类型以及黄芪黄酮和皂苷对病原菌的抑制作用,为防治该致病菌引起的根腐病以及研究黄芪次级代谢物参与黄芪抗病奠定基础,从山西省浑源县取回黄芪病株进行病原菌的分离鉴定,并研究黄芪根部总黄酮和总皂苷对病原菌生长的抑制作用;通过形态学观察、ITS序列分析和致病性鉴定,明确黄芪根腐病病原菌为腐皮镰刀菌HYFS-1。结果表明,30%的无水乙醇对腐皮镰刀菌菌落生长无影响,可作为总黄酮和总皂苷的稀释液;当总黄酮质量浓度为0.3 mg/mL时,对菌落生长具有显著抑制作用,平均抑制率为16.42%;当总皂苷质量浓度为0.5 mg/mL时,对菌落生长具有显著抑制作用,平均抑制率高达85.42%。

渭源县黄芪根腐病病原菌的分离与鉴定

对从甘肃省渭源县采集到的黄芪根腐病病株进行了病原菌的分离、纯化和致病性检测,并对致病菌形态学进行了观察,结合核糖体DNA(rDNA)ITS序列分析的分子生物学鉴定,以明确引起黄芪根腐病的致病病原菌。结果表明:黄芪根腐病致病菌为半知菌亚门(Deuteromycotina)丝孢纲(Hyphomycetes)瘤座孢目(Tuberculariales)瘤座孢科(Tuberculariaceae)镰刀菌属(Fusarium)的4个种。共分离出16个菌株,经检测有5个菌株具有致病性,均属镰刀菌,其中尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporun)1株(9号菌株),腐皮镰刀菌(Fusarium solani)2种(12号菌株和16号菌株,其中16号菌株可能为腐皮镰刀菌的变种),锐顶镰刀菌(Fusarium acuminatum)1株(15号菌株),待定镰刀菌1株(14号菌株,与三线镰刀菌的同源性仅为88%)。

黄芪根腐病菌分离鉴定及细胞壁降解酶活性比较

为了明确甘肃渭源黄芪根腐病致病菌的类型及致病力分化情况.采集具有典型黄芪根腐病状的植株并分离得到6株病原真菌,分别编号为GF1、GF2、GF3、GF4、GF5、GF6.通过形态特征和DNA-ITS及EF-1α两组基因序列分析对6株病原真菌进行鉴定,并比较了其生长速率、产孢量和致病力.对6株病原真菌的4种纤维素酶(Cx、βG)和2种果胶酶(PG、PMG、PGTE、PMTE)的酶活力进行了测定.6株黄芪根腐病原菌均为茄腐镰刀菌(Fusarium solani);菌株GF3的致病力最强,接种7 d后的病斑直径为1.43 cm,且菌株GF3的生长速率最快,培养9 d后的菌落直径为8.5 cm,培养10 d后的产孢量最大,为7.5×10^(8)个/皿;6株病原菌产果胶酶的活性均高于纤维素酶的活性,其中菌株GF3产生的的酶活力均高于其他菌株,产2种纤维素酶(Cx、βG)的酶活力也均高于其他菌株.甘肃渭源黄芪根腐病致病菌的主要类型为茄腐镰刀菌(Fusarium solani),其中菌株GF3的致病力最强,且其产的2种果胶酶(PG、PMG)和纤维素酶(Cx、βG)的酶活力高于其他菌株.

黄芪根腐病尖孢镰刀菌LAMP可视化快速检测方法的建立

由于黄芪的轮作周期缩短、连作面积连续增加,导致黄芪根腐病的发病率大大增加。目前,黄芪根腐病成为限制黄芪产量的主要因素之一,严重制约着黄芪产业的持续发展。虽然多种镰刀菌在整个种植季均可侵染黄芪,但尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)是造成黄芪根部腐烂最主要的病原菌之一。镰刀菌在不同的培养基上形态不同,由多种镰刀菌引起的黄芪根腐症状通常很难根据其形态学的特征加以区分,需要通过一些基因测序手段。翻译延伸因子(TEF-1alpha)已被广泛应用于研究镰刀菌属的种内和种间变异和系统发育。因此,可以针对TEF-1alpha区域为靶点设计LAMP引物。为了给尖孢镰刀菌的野外和现场快速检测提供新思路,为黄芪根腐病病害的田间快速诊断提供一个简便快速的新技术,研究针对尖孢镰刀菌翻译延伸因子(TEF-1alpha)序列设计引物,优化环介导等温扩增(LAMP)反应时间和温度,测试LAMP反应的灵敏性和特异性,构建黄芪根腐病尖孢镰刀菌的LAMP快速检测方法。结果表明,反应最适温度为62℃,最适时间为30 min;在最佳反应条件下,黄芪根腐病尖孢镰刀菌的LAMP快速检测方法对尖孢镰刀菌具有良好的特异性,灵敏度可达到10 pg/μL;在反应开始前加入SYBR Green I显色剂,可在反应结束后观察检测结果。