怀玉山三叶青TOM2BisoformX1基因克隆和功能分析

为揭示怀玉山三叶青TOM2BisoformX1(tobamovirusmultiplicationprotein2BisoformX1)的生物学功能提供理论依据,本研究通过怀玉山三叶青试管苗转录组数据库筛选到怀玉山三叶青TOM2BisoformX1基因的核心片段,利用RT-PCR技术克隆了该基因,并采用生物信息学、转基因瞬时表达和实时定量PCR方法对其进行序列分析、亚细胞定位、组织表达分析和功能分析。结果表明,怀玉山三叶青TOM2BisoformX1基因cDNA总长度为432bp,G+C含量为50.46%;编码143个氨基酸,分子量15392.36Da,等电点7.87,为亲水性蛋白;二级结构由α-螺旋(50.35%)、β-片层(2.10%)、无规则卷曲(47.55%)构成;三级结构为单体;预测怀玉山三叶青TOM2BisoformX1主要存在于细胞核中;怀玉山三叶青TOM2BisoformX1与葡萄(Vitis vinifera)TOM2BisoformX1(GenBank:XP_010664025.1)的同源性最高,达到83.92%。通过烟草叶片亚细胞定位分析表明,TOM2BisoformX1定位于细胞质和细胞核中。实时定量PCR结果显示,TOM2BisoformX1基因在怀玉山三叶青两个栽培种中的表达存在器官特异性,‘怀玉2号’和‘怀玉1号’均在叶中表达量最高;TOM2BisoformX1转基因阳性烟草的三叶青花叶病毒表达量显著高于TOM2BisoformX1转基因阴性烟草;与转基因阴性烟草相比,转基因阳性烟草的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)、最大光化学效率(Fv/Fm)、实际光化学量子效率(ΦPSⅡ)、光化学淬灭系数(qP)及电子传递效率(ETR)显著下降,而非光化学淬灭系数(NPQ)显著上升。怀玉山三叶青TOM2BisoformX1具有典型TOM2BisoformX1的结构特征,氨基酸序列及核酸序列与同源物种相似度高,进化上高度保守,且可促进三叶青烟草花叶病毒的增殖,降低植株的光合作用效率。

γ-氨基丁酸对怀玉山三叶青低温胁迫下试管苗生长及相关生理代谢的影响

目的探讨γ-氨基丁酸(GABA)对怀玉山三叶青低温胁迫下试管苗生长及相关生理代谢的影响,为其在怀玉山三叶青仿野生栽培中的防冻抗寒应用提供依据。方法以低温胁迫下GABA处理的怀玉山三叶青试管苗为研究对象,采用植物组织培养法测定其生长指标,植物生理生化法测定其生理指标,实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测其查尔酮合酶和黄酮醇合酶基因的相对表达量。结果与未添加GABA的对照组相比,培养基中添加0.5 g·L^(-1)GABA,怀玉山三叶青2个栽培种“怀玉1号”和“怀玉2号”试管苗的增殖系数、株高、鲜质量、干质量及组织含水量均达到最高值;可以显著提高其可溶性蛋白(SP)、可溶性糖(SS)、脯氨酸(Pro)、还原型谷胱甘肽(GSH)、抗坏血酸(AsA)、吲哚乙酸(IAA)、玉米素核苷(ZR)、赤霉素(GA3)、茉莉酸(JA)的含量,以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽还原酶(GR)的活性和查尔酮合酶(CHS)基因的相对表达量(RQ值);显著降低其相对电导率、脱落酸(ABA)、过氧化氢(H_(2)O_(2))、丙二醛(MDA)的含量,O_(2)·^(-)产生速率,以及黄酮醇合酶(FLS)基因的相对表达量。低温胁迫下GABA处理的怀玉山三叶青试管苗的生长与IAA、ZR、GA3、JA、SS、AsA、GSH的含量和CHS基因表达呈正相关。结论适当浓度的GABA可以调控内源植物激素和渗透调节物质含量、抗氧化物质含量以及次生代谢物关键基因表达,以促进低温胁迫下怀玉山三叶青试管苗的生长。

仿野生种植三叶青不同部位总黄酮分析及其抗炎、抗氧化能力比较

目的:比较仿野生种植三叶青不同部位中总黄酮含量、抗氧化活性以及抗炎能力差异。方法:采用醇提工艺对仿野生种植三叶青茎叶、块根、根须进行提取,比较不同部位间总黄酮含量差异;通过DPPH自由基、ABTS^(+)自由基、羟自由基清除实验以及铁离子还原力测定,比较仿野生种植三叶青不同部位间抗氧化能力的强弱;采用脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞作为炎症模型,通过细胞NO的释放量比较仿野生种植三叶青不同部位间的抗炎能力差异。结果:在最佳提取工艺条件下,测得仿野生种植三叶青茎叶、块根、根须总黄酮含量分别为11.86±0.23、8.48±0.10、7.52±0.02 mg·g^(-1);建立三叶青HPLC指纹图谱,共标定了10个共有峰,通过对照品指认出6号峰为芦丁、8号峰为槲皮素、9号峰为山奈酚,并对其含量进行检测,结果显示块根中三种指标成分含量均最高,其次根须,茎叶最低。检测仿野生种植三叶青不同部位对DPPH自由基、ABTS^(+)自由基以及羟自由基的IC_(50)值,茎叶分别为0.2107、0.2315、0.7625 mg/mL;块根分别为0.3134、0.3758、0.8967 mg/mL;根须分别为0.2058、0.2587、0.7856 mg/mL。三叶青茎叶、块根、根须对铁离子还原能力的吸光度值分别为0.172、0.153、0.184。当仿野生种植三叶青三部位的质量浓度在25~200μg/mL之间时,它们不会对RAW264.7细胞造成毒性,能够有效地抑制LPS诱导的NO释放,从而达到良好的抗炎效果。结论:本研究结果为仿野生种植三叶青不同部位的质量评价提供参考,并对仿野生种植三叶青非药用部位废物再利用及后续全资源开发提供理论依据。

三叶青不同部位无机营养元素的ICP-MS/MS分析与评价

为利用电感耦合等离子体串联质谱法(ICP-MS/MS)建立同时测定三叶青中Na、Mg、Al、P、S、K、Ca、Fe、Ni、Cu、Zn、Se共12种无机营养元素含量的方法,并探究不同部位(茎叶、块根、须根)的12种元素含量分布,通过ICP-MS/MS中的单杆和串联四级杆模式下的多种反应气体(O_(2)、H_(2)、NH_(3))形式建立同时分析三叶青中12种营养元素的方法,测定三叶青中不同部位的无机营养元素含量,运用单因素方差分析(ANOVA)比较药材不同部位无机营养元素含量的差异,采用偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)构建不同部位的鉴别模型。结果表明,ICP-MS/MS方法的线性、检测限、精密度、重复性和稳定性均良好,实际药材的加样回收率为90.66%~108.50%;不同部位的三叶青无机营养元素含量差异较大,地下部的无机营养元素含量显著高于地上部,Ca、Al、K、Na这4种元素是三叶青3个部位的主要差异元素。本研究通过电感耦合等离子体串联质谱法建立了快速鉴别三叶青不同部位中无机营养元素含量的方法,有效鉴定了块根、须根、茎叶中的无机营养元素含量,三叶青地下部的无机营养元素含量显著高于地上部,研究结果可以为三叶青质量控制、原产地溯源和种质资源的评价提供技术依据。

月均气温对三叶青林下容器栽培苗光合特性及其块根总黄酮含量的影响

文章比较了2015—2019年五府山月均气温对三叶青林下容器栽培苗光合生理及其块根总黄酮含量的影响。结果表明,2015—2019年,五府山1月的气温最低,2—6月气温逐渐提升,7—8月气温达到最高值,9—12月气温逐渐下降。随着1—6月气温逐渐提高,五府山三叶青林下容器栽培苗叶绿素含量SPAD值、净光合速率(P_(n))、气孔导度(G_(s))、蒸腾速率(T_(r))、气孔限制值(L_(s))、瞬时羧化速率(CUE)、初始荧光(F_(o))、最大荧光(F_(m))、光下最小荧光(F′_(o))、光下最大荧光(F′_(m))、稳态荧光(F_(s))、PSⅡ最大光能转化效率(F_(v)/F_(m))、PSⅡ潜在光化学效率(F_(v)/F_(o))、PSⅡ实际光化学效率(ΦPSⅡ)、开放的PSⅡ反应中心捕获激发能效率(F′_(v)/F′_(m))、光化学淬灭系数(q P)和块根总黄酮含量显著提高(P<0.05),胞间CO 2浓度(C_(i))、水分利用效率(WUE)和非光化学淬灭系数(NPQ)显著下降(P<0.05);气温在7—8月达到最高值,五府山三叶青林下容器栽培苗叶绿素含量SPAD值、P_(n)、G_(s)、T_(r)、L_(s)、CUE、F_(o)、F_(m)、F′_(o)、F′_(m)、F_(s)、F_(v)/F_(m)、F_(v)/F_(o)、ΦPSⅡ、F′_(v)/F′_(m)、q P和块根总黄酮含量达到最大值,C_(i)、WUE和NPQ达到最低值;9—12月气温逐渐下降,五府山三叶青林下容器栽培苗叶绿素含量SPAD值、P_(n)、G_(s)、T_(r)、L_(s)、CUE、F_(o)、F_(m)、F′_(o)、F′_(m)、F_(s)、F_(v)/F_(m)、F_(v)/F_(o)、ΦPSⅡ、F′_(v)/F′_(m)、q P和块根总黄酮含量显著下降(P<0.05),C_(i)、WUE和NPQ显著提高(P<0.05)。本试验结果可为三叶青林下容器生态栽培提供气象因子(气温)依据。

丽产特色中药材及饮片中33种禁用农药残留分析

建立超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法和气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)法评价丽产特色中药材及饮片中33种禁用农药残留情况。用乙腈高速匀浆提取低温浓缩,并结合亲水亲油平衡材料固相萃取柱净化。结果表明,33种禁用农药线性良好,相关系数均大于0.990,加标回收率为75.7%~119.7%,RSD为2.6%~9.8%。160批丽产特色中药材及饮片中有8批检出禁用农药(检出率为5%),其中1批样品超出限度(不合格率为1%),禁用农药残留情况整体良好,需重点关注灵芝孢子粉中硫丹残留。

药用植物三叶青培育技术研究进展

三叶青是中国特有珍稀药用植物,以块根或全草入药,有抗炎、抗肿瘤及保肝等重要药理作用,具有广阔的药用价值和经济价值。然而其野生资源日渐减少,并不能满足市场需求。在此背景下,国内外开始对三叶青培育技术进行了大量研究,并取得了一定的成果。结合以往相关文献,从三叶青的种源选择、基地选址、育苗繁殖、栽植模式、管理5个方面对三叶青生长发育影响进行了系统的阐述与总结,以期为三叶青的培育提供技术参考和借鉴。

三叶青黄酮诱导SGC-7901胃癌细胞凋亡的实验研究

目的:观察三叶青黄酮对SGC-7901人胃癌细胞凋亡的诱导作用,初步探讨其可能的机制。方法:体外培养SGC-7901人胃癌细胞,并用MTT法检测三叶青黄酮对肿瘤细胞生长的抑制作用,流式细胞仪分析细胞周期,光镜和电镜观察细胞形态改变,酶谱分析基质金属蛋白酶-2(MMP-2)蛋白的表达改变。结果:三叶青黄酮能显著地抑制SGC-7901细胞的生长,并且具有浓度依赖性,且细胞有明显的凋亡特征性改变,并能降低细胞上清液中MMP-2的含量。结论:三叶青黄酮具有抗肿瘤细胞增殖和诱导凋亡的作用,有潜在的抗肿瘤价值,值得进一步研究。

蛇附子中4种黄酮类成分的分离及含量测定

目的：研究蛇附子中4种黄酮类成分的分离及其含量测定。方法：采用质谱引导自动纯化系统分离蛇附子中4种黄酮类成分,应用NMR、HR-MS、UV等波谱学方法进行结构鉴定;采用UHPLC-DAD法测定含量,Kinetex C18色谱柱（100 mm×4.6 mm,2.6μm）,以乙腈（B）-0.1%甲酸（A）为流动相,梯度洗脱,流速0.4 m L/min,检测波长350 nm,柱温30℃。结果：从蛇附子中分离得到4个黄酮类化合物,分别鉴定为：芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷;4个成分的线性范围分别为0.283~11.32μg/m L（r1=0.9998）、0.311~12.44μg/m L（r2=0.9994）、0.277~11.08μg/m L（r3=0.9995）、0.103~2.06μg/m L（r4=0.9990）,平均加样回收率分别为99.75%（RSD=2.15%）、98.73%（RSD=2.58%）、98.03%（RSD=2.23%）、97.62%（RSD=1.95%）。结论：4个黄酮类化合物均为首次从该植物中分离得到,建立的UHPLC-DAD定量分析方法简便、快捷、准确,可作为蛇附子的质量控制方法。

三叶青愈伤组织培养及其总黄酮含量的研究

目的:通过三叶青愈伤组织诱导、增殖、分化及其总黄酮含量测定,探讨用三叶青愈伤组织生产三叶青黄酮的可行性。方法:以无菌苗叶片、野生三叶青叶片和茎段为外植体,诱导形成愈伤组织;经不同培养基培养后,选取两种典型的愈伤组织、叶片和块根为材料,以乙醇为溶剂,超声波提取总黄酮,用NaNO2-Al(NO3)3显色,在500nm处用分光光度计测总黄酮含量。结果:三叶青愈伤组织的最佳诱导培养基为2/3MS+2.0mg/L6-BA+2.0mg/LNAA,最佳增殖培养基为MS+2.0mg/L6-BA+2.0mg/LNAA,最佳生根培养基为1/2MS+1.0mg/L6-BA+1.0mg/LNAA。三叶青总黄酮含量在块根中为31.135mg/g,在叶片中为12.830mg/g,在愈伤组织中高达18.047mg/g。结论:三叶青愈伤组织中总黄酮含量较高,用愈伤组织可大规模生产三叶青黄酮,满足医药市场的迫切需求。

濒危药用植物三叶青研究进展

三叶青为中国特有的具有重要药用价值的植物。现代药理研究表明,三叶青具有较好的抗肿瘤活性,黄酮类化合物是三叶青的主要组成成分和功效成分。在相关文献的基础上,从植物学、化学成分、毒理药理学、临床应用、人工栽培、生物技术等方面对三叶青在各个领域的研究成果进行了总结,并探讨了今后的研究方向,在保护濒危种质资源三叶青的同时,为合理开发与利用三叶青的药用价值提供科学依据。

中草药三叶青抗肿瘤作用机制实验研究和临床应用

目的拟对民间常用中草药三叶青抗恶性肿瘤作用机制做深入的实验研究,并在此基础上按《保健食品注册管理办法(试行)》要求以三叶青为主,配以药食同用的黄芪、人参皂苷制成制剂金芪片经过临床验证研制成抗恶性肿瘤的功能性保健食品。方法按《保健食品检验与评价技术规范》对三叶青进行抗肿瘤功能实验、提高人体免疫功能实验和食品安全性毒理学评价实验,证实三叶青有明显抗肿瘤作用,且长期服用安全无毒。以三叶青为主配以黄芪、人参皂苷制成的制剂金芪片经临床验证,证实疗效确切无毒副反应。结果各项实验结果证实三叶青及金芪片提取物对人体肝癌细胞HepG2活性具有较强抑制作用,对小鼠HepG2细胞的端粒酶基因表达有抑制作用,并又增强小鼠细胞免疫和体液免疫功能的作用。三叶青提取物经急性毒性试验及长期毒性实验证实安全无毒。金芪片临床验证:120例恶性肿瘤病人服用90天,完全缓解52例,部分缓解42例,稳定18例,进展8例,总有效率78.33%。结论表明三叶青及其制剂金芪片对恶性肿瘤病人有较好的效果,值得推广,并可期盼做进一步研究开发成抗恶性肿瘤新药。

三叶青黄酮对H-22荷瘤小鼠瘤体的抑制作用及其机理研究

[目的]观察三叶青总黄酮对H-22荷瘤小鼠瘤体的抑制作用,探讨其作用机理。[方法]小鼠肝癌H-22细胞右前肢腋窝皮下接种造膜,观察低、中、高剂量三叶青黄酮对荷瘤小鼠抑瘤率、脾脏指数、胸腺指数的影响,并通过定量RT-PCR检测小鼠皮下移植瘤Fasp-3、CytC的表达情况。[结果]低、中、高剂量三叶青黄酮对H-22荷瘤小鼠的瘤重抑制率分别为34.28%、32.56%和29.24%;皮下移植瘤Fasp-3、CytC mRNA的表达低剂量组明显高于空白组(P<0.05)。[结论]三叶青黄酮可显著抑制肿瘤细胞,这一作用与其能促进肿瘤细胞的促凋亡基因Fasp-3、CytC的表达相关。

不同种源三叶崖爬藤表型多样性分析

对同质园栽培的来自14个种源的三叶崖爬藤(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)的10个表型性状进行比较,并进行聚类分析和相关性分析。结果表明:除新稍长和单株块茎数量外,三叶崖爬藤的茎粗、叶长、叶宽、单叶面积、块茎直径、单株块茎鲜质量以及块茎中总黄酮和多糖含量在种源间的差异达到极显著水平。三叶崖爬藤10个表型性状的变异系数在17.03%~51.95%之间,其中,块茎直径和单株块茎鲜质量的变异系数较大,分别为51.95%和48.59%。聚类分析结果显示:14个种源三叶崖爬藤聚为2类,其中,浙江6个种源聚为一类,该类三叶崖爬藤的茎较纤细,叶片较小,块茎中总黄酮和多糖含量较高;湖南、湖北、江西和广西种源聚为另一类,该类三叶崖爬藤的茎粗壮,叶片较大,块茎直径和单株块茎鲜质量较大。相关性分析结果显示:三叶崖爬藤块茎直径和单株块茎鲜质量与茎粗、新稍长、叶宽和单叶面积呈极显著正相关,块茎中总黄酮和多糖含量与茎粗、新稍长、叶长、叶宽、单叶面积、块茎直径和单株块茎鲜质量总体上呈极显著负相关。研究结果显示:三叶崖爬藤表型性状可作为种源划分和优良种源筛选的依据。

三叶青黄酮对荷Lewis肺癌鼠免疫抑制相关细胞因子的干预作用

目的:研究三叶青黄酮对荷Lewis肺癌模型小鼠的瘤体及免疫抑制相关细胞因子表达的影响,初步探讨三叶青总黄酮逆转肿瘤免疫逃逸的可能机制。方法:匀浆接种法建立C57BL/6小鼠Lewis细胞肺癌模型,连续给药14d后观察正常组、模型对照组、三叶青黄酮高、中、低剂量组瘤体增长情况及血清中转化生长因子β1(TGF-β1)、前列腺素E2(PGE2)、环氧化酶-2(COX-2)表达含量。结果:瘤体:高剂量组、中剂量组与模型对照组相比较瘤体大小有统计学差异(P<0.05),瘤体大小依次为:模型对照组>低剂量组>中剂量组>高剂量组。血清TGF-β1表达、PGE2和COX-2含量:各实验组均明显高于正常组(P<0.01),高剂量组<低剂量组(P<0.05)。结论:三叶青黄酮高剂量组抑瘤效果较好,中剂量抑瘤效果次之,低剂量组抑瘤效果不明显。三叶青黄酮的抑瘤作用可能与降低外周血中TGF-β1的表达水平有关,可能通过影响PGE2、COX-2表达水平,从而达到逆转肿瘤逃逸,起到抗肿瘤作用。

不同光照强度对三叶青生长发育及其总黄酮的影响

目的:研究不同光照强度对三叶青的生物量、叶绿素含量及总黄酮含量的影响,筛选三叶青最佳光照条件。方法:选用“闽选1号”三叶青扦插苗移植于大棚中,用黑色遮阳网遮阴后光照强度分别为自然光照的5%~10%、20%~30%、30%~45%,每隔45 d进行测定和取材,共8次;叶绿素计测定叶绿素相对含量,以芦丁为对照,在波长500 nm测定三叶青藤茎、叶及块根的总黄酮含量。结果:随着光照强度的增强,三叶青地上部生物量与叶绿素的含量逐渐降低,而地下部生物量与块根中总黄酮含量逐渐上升,表明荫蔽环境有利于三叶青地上部的生长,而适度增加光照强度有利于三叶青块根的发育及总黄酮的累积。结论:透光度20%~30%的条件较适合三叶青的生长发育和黄酮类成分的累积。

中药三叶青提取物抗肿瘤机制初探

目的:通过对三叶青提取物小鼠免疫调节功能的评价,初步确定其抗肿瘤作用的基本机制。方法:从细胞免疫、体液免疫、单核-巨噬细胞吞噬作用和自然杀伤细胞的攻击作用4个方面观察三叶青提取物对小鼠免疫功能的影响。结果:三叶青提取物5.0、15.0、25.0 g/kg.BW剂量组均能提高ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞的增殖能力和小鼠左后足跖部厚度差24 h测量值;2.5、5.0 g/kg.BW剂量组均能提高小鼠溶血空斑数;2.5、5.0、15.0和25.0 g/kg.BW剂量组均能提高小鼠碳廓清的能力;15.0 g/kg.BW剂量组能提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬指数。结论:三叶青提取物具有增强小鼠免疫力作用,为其抗肿瘤作用机制之一。

三叶青抗慢性肝损伤实验研究

目的观察三叶青对慢性肝损伤的保护作用。方法CCl4反复多次给药,造成大鼠慢性肝损伤,检测造模动物血清ALT、AST、HA、LN、T-Bili、TP、ALB水平及A/G。结果三叶青可降低造模大鼠血清ALT、AST、HA、LN及T-Bili水平,抑制造模动物血清TP、ALB水平及A/G的下降和提高大鼠存活率。结论三叶青具有良好的保肝降酶及抗肝纤维化作用。

畲药三叶青饮片的HPLC指纹图谱研究

目的:建立三叶青饮片HPLC指纹图谱及评价体系。方法:采用Agilent ZORBAX SB-C_(18)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以乙腈-0.2%磷酸溶液为流动相,梯度洗脱;流速:1.0 mL/min,检测波长:360 nm,柱温:35℃;利用"中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)"计算相似度,采用聚类分析法对指纹图谱进行模式识别。结果:建立了三叶青饮片HPLC指纹图谱共有模式,标定7个共有峰,除了S2和S6号样品以外,其他批号饮片与对照图谱的相似度为0.941～0.973;指认其中5个成分分别为芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、山柰酚。结论:指纹图谱和模式识别相结合方法是三叶青饮片质量控制的一种有效的评价方法。

三叶青的研究进展

三叶青是我国特有的珍稀药用植物,自发现具有抗肿瘤作用以来,价格不断攀升,对三叶青的研究逐渐增多.本文就三叶青在开发利用价值、种质资源、种苗繁育、栽培技术等方面进行综述,并探讨了今后的研究方向,为三叶青的开发利用提供参考.