聚合酶链反应-单链构象多态性技术检测耐多药结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL突变的研究

目的 应用PCR SSCP技术快速检测耐INH ,RFP ,SM结核分支杆菌分离株KatG、rpoB、rpsL基因突变 ,评价其在检测结核分支杆菌耐药性方面的价值。方法 32株耐INH、RFP、SM结核分支杆菌临床分离株及 2 5株结核分支杆菌敏感分离株用PCR SSCP方法分别检测 ,rpoB、KatG、rpsL基因突变。结果 32株耐多药结核分支杆菌分离株中 ,rpoB、KatG、rpsLPCR扩增产物PCR SSCP分别有 2 8株 (87.5 % )rpoB基因 ,19株 (5 9.3% )KatG基因和 2 3株 (71.9% )rpsL基因电泳条带与结核分支杆菌标准株H3 7Rv电泳条带相比有明显差异 ,而 2 5株结核分支杆菌敏感株的PCR SSCP条带与结核分支杆菌H3 7Rv相似 ,特异性为 10 0 %。结论 PCR SSCP方法敏感、特异 ,可快速检测结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL耐药基因突变 。

广东地区临床分离结核分枝杆菌KatG、rpoB、rpsL耐药基因变异研究

目的本研究主要针对从广东地区500例疑似结核病患者痰液中分离的结核分枝杆菌对异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)耐药情况与其对应的突变基因katG、rpoB、rpsL关系研究。方法采用PCR和DNA测序法对结核分枝杆菌临床分离株katG、rpoB和rpsL基因进行序列分析。结果分离得到耐INH35株、耐RFP27株、耐SM25株。INH耐药株katG基因突变率为71.4%(25/35),RFP耐药株rpoB基因的突变率为81.5%(22/27),SM耐药株rpsL基因突变率为76%(19/25);INH以Ser315Thr突变60%(21/35)最常见,RFP以Ser531Leu突变55.6%(15/27)最常见,SM以Lys43Arg位氨基酸突变72%(18/25)常见。结论 katG、rpoB和rpsL基因突变被证实是广东地区结核分枝杆菌INH、RFP和SM耐药性产生的主要分子机制,PCR-DNA测序法可快速检测结核分枝杆菌INH、RFP和SM耐药性。

牛结核分支杆菌临床分离株rpsL,rpoB,KatG基因突变分析

采用噬菌体生物扩增法对本实验室分离鉴定的25株奶牛结核分支杆菌进行药敏分析,检测出14株耐链霉素、利福平、异烟肼菌株.用PCR扩增耐药株的rpsL基因片段(370 bp)、rpoB基因片段(213 bp)和KatG基因片段(458 bp),并对目的片段进行测序分析,其中5株耐链霉素菌株的rpsL基因在43位点发生突变,均由赖氨酸密码子(AAG)突变为精氨酸密码子(AGG);5株利福平耐药株的rpoB基因在531位点、526位点、511位点发生突变,其中有3株分离株的rpoB基因在531位点发生点突变,1株分离株的rpoB基因在526位点发生突变,1株分离株的rpoB基因在531位点和511位点发生了较为少见的联合突变;4株异烟肼耐药菌株,其中2株在315位点发生碱基突变,2株在463位点发生碱基突变.

用PCR-SSCP技术检测结核分支杆菌rpoB,KatG,rpsL基因突变

目的 用PCR -SSCP技术检测肺结核患者痰及分离株结核分支杆菌rpoB ,KatG ,rpsL基因突变 ,了解耐药分子机制及探索痰标本结核分支杆菌耐RFP ,INH ,SM直接检测的可行性。方法 对 3 2例耐INH ,RFP ,SM肺结核患者临床痰标本及 3 0株耐INH ,RFP ,SM结核分支杆菌临床分离株行PCR -SSCP方法检测rpoB ,KatG ,rpsL基因突变。结果 3 2份耐多药临床痰标本中rpoB ,KatG ,rpsL基因扩增产物SSCP其电泳条带与结核分支杆菌标准株H3 7Rv电泳条带相比 ,基因突变阳性分别为 2 8/ 3 2 ,19/ 3 2 ,2 3 / 3 2 ,3 0例结核分支杆菌临床分离株rpoB ,KatG ,rpsL基因突变阳性为2 8/ 3 0 ,18/ 3 0 ,2 2 / 3 0。结论 PCR -SSCP方法敏感、特异 ,可快速检测结核分支杆菌rpoB ,KatG ,rpsL基因突变 。

吉林省耐多药结核分枝杆菌rpoB及katG基因突变特征分析

目的分析吉林省耐多药结核分枝杆菌临床分离株rpoB、katG基因突变特点,为建立本省快速耐多药检测方法提供参考。方法对吉林省耐多药结核分枝杆菌菌株扩增rpoB、katG基因测序后比对分析。结果耐多药结核分枝杆菌rpoB、katG基因的突变率分别为83.53%和70.6%,突变类型包括点突变、联合突变和缺失。在rpoB基因中,82.30%突变发生在RRDR区域,最常见突变位点为rpoB 531、rpoB 526、rpoB 516。KatG基因突变率为70.6%,最常见突变位点为katG315,占所有突变的68.55%。结论吉林省耐多药结核分枝杆菌最常见突变位点为rpoB531、rpoB 526、rpoB 516和katG 315。

PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分支杆菌rpoB,katG,ahpC基因突变的研究

目的应用PCR -SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分支杆菌rpoB ,katG及ahpC基因突变 ,评价此方法用于结核分支杆菌利福平 (RFP)及异烟肼 (INH)耐药性试验的意义。方法以结核分支杆菌H3 7Rv为对照 ,30例耐RFP(单耐或多耐 )、2 1例耐INH(单耐和多耐 )的结核分支杆菌临床分离株及 10例敏感菌株 ;39例菌阳肺结核患者及 30例非结核性肺部疾病患者痰标本 ,采用PCR SS CP技术检测痰标本和菌株中的结核杆菌rpoB ,katG ,ahpC基因突变 ,并与药敏试验对照。结果PCR -SSCP检测痰标本中结核分支杆菌rpoB ,katG及ahpC基因突变的阳性率分别为 79% (31/ 39)、46 % (18/39)及 5 % (2 / 39)。结论PCR -SSCP可望成为直接检测临床痰标本中结核分支杆菌耐利福平及耐异烟肼的快速方法。

牛结核分枝杆菌临床分离株rpoB、KatG基因突变分析

为了解牛结核分枝杆菌临床分离菌株对利福平(RFP)、异烟肼(INH)的分子耐药机制,本研究采用噬菌体生物扩增法对分离并鉴定的25株牛结核分枝杆菌进行药敏分析,筛选出9株耐利福平、异烟肼菌株,PCR扩增耐药株的rpoB基因片段(213bp)和KatG基因片段(458bp)并测序。通过对耐药基因的测序分析,5株利福平耐药株的rpoB基因在531位点(RNA聚合酶β-亚基编码基因起始密码子起,下同)、526位点、511位点发生突变,其中有3株rpoB基因531位点发生突变,1株rpoB基因526位点突变;1株rpoB基因在531位点和511位点发生了较为少见的联合突变;4株异烟肼耐药菌株,其中2株在315位点(KatG蛋白编码基因起始密码子起,下同)发生碱基突变,2株在463位点发生碱基突变。

Detecting drug resistant genetic mutation among pneumoconiosis patients complicated with tuberculosis in Mycobacterium tuberculosis L-forms application of PCR-SSCP technique in Huainan mining district

Objective： To study the relationship between drug resistant genetic mutation and drug resistance in Mycobacterium tuberculosis L-form, discuss the internal relationship between drug resistances and drug-resistant related genes and explore the value of PCR- SSCP to clinical application. Methods： A total of 52 clinically isolated strains of tuberculosis L-form were collected among 97 pneumoconiosis patients complicated with tuberculosis. The gene mutations of katG, rpoB and rpsL were detected by PCR-SSCP, and the results were compared with those analyzed by traditional antimicrobial susceptibility test（AST）. Results： The gene muta- tion rates of katG, rpoB and rpsL by PCR-SSCP were respectively 57.70% （30/52）, 65.38% （32/52） and 40.38% （21/52）. The rate of reversion was 78.85%（41/52） and the result of drag-resistant genes was invariable. The results of AST showed that there were 40 （76.92%） multi-drug resistant strains in 52 clinically isolated strains. The number for three-drug resistant strain was 21 （40.38%） and that of two-drug resistant was 19（36.54%）, but only 12（23.08%） strains were one drug resistant. The rate of total drug-resistance was 100%, but there were 15 strains of allied mutation of three genes, 16 of two mutations and 6 of only one by PCR-SSCP. The coincidences were respectively 71.43%, 84.12% and 50.00%. Then there was no significant difference between the allied mutations of multi-drug resistant gene and the mutations of only one drug resistant gene （P 〉 0.05）. Conclusion： PCR-SSCP technique has a higher sensibility and specificity to detect the genes of katG, rpoB and rpsL in tuberculosis L-form among pneumoconiosis complicated with tuberculosis,and the detecting rate of two drug resistant strains and three drug resistant strains was higher. The combined application of PCR-SSCP and AST has advantages at earlier diagnosis and guidance of clinical medications.

结核分枝杆菌katG、rpoB、rpsL耐药基因快速检测方法的建立

目的:建立一套应用multi-PCR-SSCP(multiple-Polymerase Chain Reaction-Single Strand Cinformation Poly-morphism)快速检测结核分枝杆菌耐药基因突变的方法,评价该方法的临床应用价值。方法:分别用常规PCR和multi-PCR-SSCP检测58株结核分枝杆菌临床分离株katG、rpoB、rpsL基因突变并与常规药敏试验检测结果进行对比。结果:经常规药敏试验检测,58株结核分枝杆菌临床分离株中有41株耐药,其中,耐异烟肼(INH)35株;耐利福平(RFP)31株;耐链霉素(SM)31株。单基因PCR-SSCP与multi-PCR-SSCP分析结果一致,检出katG、rpoB、rpsL基因的突变率分别为65.7%(23/35)、84%(26/31)、71%(22/31),17株药物敏感株中有1株rpoB基因SSCP电泳条带与结核杆菌标准株结果有差异。结论:multi-PCR-SSCP方法敏感、特异,可快速检测结核分枝杆菌katG、rpoB、rpsL耐药基因的突变,将该方法与药敏试验联合应用可互相弥补,成为临床指导用药的好方法。

中国部分地区结核分支杆菌耐利福平、异烟肼和链酶素耐药基因的检测

目的研究我国部分地区耐利福平(RFP)、异烟肼(INH)和链酶素(SM)结核分支杆菌临床分离株rpoB基因、KatGr、psL基因突变情况,评价其耐药分子机制。方法采用PCR和聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)对373株结核分支杆菌临床分离株(其中敏感株148株,耐RFPI、NH、SM株共225株)rpoB基因、KatG和rpsL基因进行检测。并对其中19株SSCP阴性的耐RFP株用双脱氧末端终止法进行测序分析。结果安徽省、北京市、上海市、河北省、河南省、辽宁省、吉林省结核分支杆菌耐RFP临床分离株rpoB基因突变率分别为90%、91%、90%、91%、90%、93%、91%;KatG基因突变率分别为69%、63%、71%、68%、67%、68%、65%,rpsL基因突变率71%、69%、74%、68%、70%、61%、76%,分别为经统计学处理不同地区间无显著性差异(χ2=0.46,P>0.05)。同时rpoB基因敏感株均无突变,特异性为100%;KatG基因有3株发生突变,特异性为98%。19株SSCP阴性耐药株中经测序6株在531位密码子TCG→TTG,1株526位密码子CAC→TAC,7株发生在516位密码子GAC→GTC,5株未改变。结论我国不同地区耐利福平、异烟肼和链霉素的rpoB、KatGr、psL耐药基因突变率大致相同,rpoB基因、KatG和rpsL基因突变分别是耐RFP、INH和SM结核分支杆菌耐药性产生的主要分子机制,PCR-SSCP可快速检测结核分支杆菌RFPI、NH和SM耐药性。

PCR-SSCP法检测结核分枝杆菌耐药性

目的 :探讨耐多药结核分枝杆菌耐药基因突变与耐药性的关系以及聚合酶链反应 单链构象多态性分析 (poly merasechainreaction singlestrandcinformationpolymorphism ,PCR SSCP)方法的临床应用价值 .方法 :用PCR SSCP方法检测 5 8株结核分枝杆菌临床分离株katG ,rpoB ,rpsL基因突变并与常规药敏试验检测结果进行对比 .结果 :经常规药敏试验检测 ,5 8株结核分枝杆菌临床分离株中共有 4 1株耐药 ,其中 ,耐异烟肼 (INH)为 35株 ,高耐药株 2 7株 ;耐利福平(RFP)为 31株 ,高耐药株 2 4株 ;耐链霉素 (SM)有 31株 ,高耐药株 2 6株 .同时耐 3种药物的有 2 1株 (5 1 .2 % ) ,耐 2种药物的 1 4株 (34.1 % ) ,单耐药株 6株 (1 4 .6 % ) .PCR SSCP方法对 5 8株临床分离株katG ,rpoB ,rpsL基因突变的检测率为4 0 % (2 3/5 8) ,4 5 % (2 6 /5 8) ,38% (2 2 /5 8) ,其中检出 3个基因同时突变的有 1 3株 (32 % ) ,2种基因突变的 1 2株 (2 9% ) ,1种基因突变的有 1 0株 (2 3.8% ) .常规药敏试验与PCR SSCP法检出结核分枝杆菌同时耐 3种药物的符合率为 6 1 .9% (1 3/2 1 ) ,检出耐 2种药物的符合率为 85 .7% (1 2 /1 4 ) ,检出耐 1种药物的符合率为 5 0 % (3/6 ) .高耐药株中突变率为 80 .5 %(6 2 /77) ,低耐药株中突变率?

PCR-SSCP方法用于痰标本中结核分支杆菌耐药基因的检测

目的探讨采用直接检测结核病人痰标本中rpoB基因和KatG基因突变。评价该方法检测结核分支杆菌对利福平(RFP)和异烟肼(INH)耐药性。方法用PCR-SSCP技术分析,对35例耐INH(或含耐异烟肼)、63例耐RFP(或含耐RFP)的肺结核病人痰标本和20例非结核性肺部疾病组痰标本进行rpoB和KatG基因突变的检测。结果以结核分支杆菌H37RV为对照,63例耐RFP痰标本中57例PCR扩增阳性,其中46例SSCP图谱与H37Rv标准株有差异,rpoB突变率为65.2%。35例耐INH肺结核病人痰标本有20例扩增阳性,15例SSCP图谱与H37Rv标准株有差异,突变率为42.8%。20例非结核病人痰标本rpoB基因和KatG基因扩增均为阴性。结论PCR-SSCP技术有望成为结核分支杆菌耐药性检测的重要方法之一。

结核分枝杆菌三种耐药基因的检测方法

建立3种结核分枝杆菌耐药基因的检测方法,探讨耐药基因突变与耐药性的关系。将58株临床分离株均做聚 合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)和传统药物敏感试验。结果表明,结核分枝杆菌耐药基因突变与耐药 水平有密切联系,绝大多数结核分枝杆菌耐药基因突变发生在高耐药株,少部分在低耐药株发生基因突变。

等位基因特异性PCR法快速检测结核分枝杆菌常见耐药突变基因

目的建立一套同步检测结核分枝杆菌(MTB)常见耐药突变基因的等位基因特异性PCR(AS-PCR)检测体系,以间接判断对利福平(RFP)与异烟肼(INH)的耐药性。方法用AS-PCR技术同步检测58株MTB临床分离株rpoB基因516位、526位和531位,katG基因315位及inhA基因-15位密码子突变,并与DNA测序结果进行比对。结果 AS-PCR法对RFP耐药株检出率为95.1%(39/41),其中rpoB基因531位、526位、516位点突变分别检出28株、10株、2株,包括531位与526位联合点突变1株;未检出突变的2株RFP耐药株经测序验证1株未发生突变、1株发生533位点突变;RFP敏感株均未检测到突变。AS-PCR法对INH耐药株检出率为86.5%(45/52),其中katG基因315位点突变43株、inhA基因-15位点突变2株,未检出突变的7株INH耐药株经测序验证未见突变;INH敏感株均未检测到突变。结论等位基因特异性PCR能够快速检测MTB常见突变基因,具有较高的敏感性与特异性,快速经济、操作简便。

结核分支杆菌耐药分子机制的检测技术的研究

目的 :探讨结核分支杆菌对异烟肼、利福平耐药的分子机制 ,建立快速检测耐药分支杆菌基因型的分子生物学方法。方法 :采用聚合酶链反应 -单链构象多态性 (PCR -SSCP)同时检测结核分支杆菌敏感株和耐异烟肼、利福平耐药株的KatG基因、rpoB基因突变。结果 :78株结核分支杆菌临床分离株均未发现KatG、rpoB基因缺失。以结核分支杆菌H37RV为对照 ,3 6株药物敏感株的KatG、rpoB基因SSCP图谱均正常。 42株同时耐异烟肼和利福平的多耐药株中 ,KatG和rpoB基因突变率分别为 66.7% (2 8/4 2 ) ,90 .5 % (3 8/4 2 )。结论 :结核分支杆菌耐异烟肼、利福平耐药性的产生是由于KatG基因和rpoB基因突变所致。应用PCR -SSCP技术可同时快速检测结核分支杆菌异烟肼。

耐多药结核分支杆菌基因突变在老年结核病病人耐药性检测中的应用

目的探讨耐多药结核病(MDR-TB)临床分离株rPOB、KatG和rpsL基因突变在结核病耐药性检测中的应用价值。方法采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术分析了同时耐异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)的多耐药临床分离株和35株药物敏感株的rPOB、KatG、rpsL基因突变。结果以结核分支杆菌H37RV为对照,35株药物敏感株的rPOB、rpsL基因SSCP图谱正常,其特异性为100%;KatG基因有2株图谱异常,特异性为94.3%。71株结核分支杆菌临床分离株均未发现rPOB、KatG、rpsL基因缺失,其PCR扩增产物SSCP分析结果表明36株多耐药临床分离株中,32株rPOB基因图谱异常;21株KatG基因图谱异常;26株rpsL基因图谱异常。其敏感性分别为rPOB(88.9%)、KatG(58.3%),rpsL(72.2%)。结论结核分支杆菌耐RFP、INH、SM耐药性的产生主要是由于rPOB、KatG和rpsL基因突变所致。PCR-SSCP技术有望成为结核分支杆菌耐药性检测的方法之一。

糖尿病合并肺结核患者耐多药结核分枝杆菌基因突变的检测

目的:探讨耐多药结核分枝杆菌临床分离株rPOB、KatG和rpsL基因突变在糖尿病合并肺结核患者耐药性检测中的应用价值。方法:采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术对41株自糖尿病合并肺结核患者痰液中培养分离的同时耐利福平(RFP)、异烟肼(INH)、链霉素(SM)的多耐药临床分离株和46株对RFP、INH、SM敏感株的rPOB、KatG、rpsL基因突变状况。结果:46株药物敏感株的rPOB、KatG、rpsL基因SSCP图谱正常,特异性为100%。PCR扩增产物SSCP分析结果显示:41株多耐药临床分离株中,36株rPOB基因图谱异常,26株KatG基因图谱异常,29株rpsL基因图谱异常,检测敏感性分别为rPOB(87.8%)、KatG(63.4%),rpsL(70.7%)。结论:结核分枝杆菌对RFP、INH、SM产生耐药性的机制主要是由于rPOB、KatG和rpsL基因突变所致。

耐多药结核分支杆菌基因突变在耐药性检测中的应用

目的 探讨耐多药结核病 (MDR -TB)临床分离株rpoB ,KatG和rpsL基因突变在耐药性检测中的应用价值。方法 采用聚合酶链反应 -单链构象多态性 (PCR -SSCP)技术分析了同时耐异烟肼 (INH)、利福平 (RFP)、链霉素(SM)的多耐药临床分离株和 3 5株药物敏感株的rpoB ,KatG ,rpsL基因突变。结果 以结核分支杆菌H3 7RV为对照 ,3 5株药物敏感株的rpoB ,rpsL基因SSCP图谱正常 ,其特异性为 10 0 % ;KatG基因有 2株图谱异常 ,特异性为 94%。 71株结核分支杆菌临床分离株均未发现rpoB ,KatG ,rpsL基因缺失 ,其PCR扩增产物SSCP分析结果表明 ,3 6株多耐药临床分离株中 ,3 2株rpoB基因图谱异常 ,2 1株KatG基因图谱异常 ,2 6株rpsL基因图谱异常 ;其敏感性分别为rpoB(89% ) ,KatG(5 8% ) ,rpsL(72 % )。结论 结核分支杆菌耐RFP ,INH ,SM耐药性的产生主要是由于rpoB ,KatG和rpsL基因突变所致 ;PCR -SSCP技术有望成为结核分支杆菌耐药性检测的方法之一。

尘肺结核患者Mycobacterium tuberculosis耐药基因突变研究

研究尘肺结核患者结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)耐药基因突变与耐药性的关系。在97例尘肺结核患者痰中检出MTB菌株28株,采用PCR-SSCP法检测katG、rpoB和rpsL基因突变,并与采用常规药敏试验(AST)法检测的耐药结果进行对比分析。采用PCR-SSCP法检测katG、rpoB和rpsL基因,突变率分别为42.86%(12/28)、42.86%(12/28)和32.14%(9/28),采用AST法检测INH、RFP和SM,耐药率分别为64.23%(18/28)、60.71%(17/28)和53.57%(15/28),两者之间差异均无显著性(P>0.05)。其中多耐药株20例(71.43%),包括耐三种药物12例(42.86%),耐两种药8例(28.57%),单耐药株6例(21.43%),敏感株2例,耐药率92.86%。PCR-SSCP法检出3个基因联合突变8株,与AST法符合率为66.67%(8/12);2个基因突变5株,符合率为62.50%(5/8);单基因突变2株,符合率为33.33%(2/6)。结果表明:PCR-SSCP技术适用于MTB katG、rpoB和rpsL耐药基因突变的筛选,对指导尘肺结核患者临床用药上具有重要意义。