牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌强菌株rpoE蛋白的原核表达及其免疫保护效力研究

为研究牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌(PM)强菌株rpoE蛋白的免疫保护性,本研究利用PCR方法扩增牛荚膜A型PM的rpoE基因,构建pET-28a-rpoE重组表达质粒,经诱导表达后SDS-PAGE检测结果显示,表达的rpoE蛋白相对分子量约为20 ku,与理论值一致;western blot结果显示该蛋白具有很好的特异性和反应原性;纯化的rpoE蛋白经皮下免疫BALB/c小鼠,间接ELISA检测融合蛋白的免疫原性,结果显示rpoE蛋白可以诱导小鼠产生较高水平的特异性抗体;PM攻毒后,免疫组保护率为70%。本研究获得的牛荚膜A型PM重组rpoE蛋白具有良好的免疫原性,免疫小鼠后能够提供一定的保护,可以作为研发PM亚单位疫苗的候选抗原。

猪链球菌rpoE基因克隆及生物信息学分析

本研究旨在克隆猪链球菌rpoE基因,并通过生物信息学软件预测分析猪链球菌rpoE基因编码蛋白功能及其调节机制。以猪链球菌基因组为模板扩增rpoE基因,成功测序后通过生物信息学软件预测该基因编码蛋白的理化性质、抗原表位等。结果表明,成功克隆的猪链球菌rpoE基因全长582 bp,编码一种富含谷氨酸、天冬氨酸及丝氨酸的亲水性胞质蛋白;二级结构分析显示,RpoE蛋白主要结构元件为α-螺旋和无规则卷曲,分别占52.3%和36.3%。综合分析认为,RpoE蛋白上存在5个优势抗原表位。

肉制品加工中脂肪对甲型副伤寒沙门氏菌rpoE的应激特性

目的:为了解甲型副伤寒沙门氏菌缺陷株和野生株在肉制品加工过程不同介质中的热应激响应特征,并进一步探究肉制品加工中脂肪对甲型副伤寒沙门氏菌rpoE表达的影响。方法:以55,63,72℃对接种108CFU/g甲型副伤寒沙门氏菌缺陷株△rpoE和野生株在不同介质下进行热处理,测定处理后样品中甲型副伤寒沙门氏菌的残存数量,比较缺陷株和野生株在不同介质下的失活情况,对野生株和缺陷株在不同介质下的耐热情况进行分析,然后以Real-time PCR法检测野生株在近似巴氏杀菌条件下不同介质中热处理后的残存菌体样本的rpoE基因的表达水平,比较脂肪对rpoE表达水平的影响。结果:缺陷株和野生株D值之间存在显著性差异(P<0.05),缺陷株的D值都明显低于野生株,相同温度下缺陷株和野生株分别在肥瘦1∶1和纯瘦肉介质之间的D值都存在显著性差异(P<0.05),肥瘦介质中菌株更耐热,野生株在肥瘦1∶1和纯瘦肉介质的近似巴氏杀菌条件下,表达上调水平分别为3.53,3.29倍,且不存在显著性差异(P>0.05)。结论:肉制品在巴氏杀菌近似条件下,甲型副伤寒沙门氏菌通过提高rpoE的表达水平来增加甲型副伤寒沙门氏菌的耐热性。脂肪对菌株的耐热性起重要作用,并不会通过调节rpoE的表达来提高耐热性。

牦牛源多杀性巴氏杆菌rpoE基因缺失株的构建及生物学特性分析

为研究牦牛源多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)rpoE基因在Tibet-Pm1菌株中的部分生物学特性,试验利用同源重组技术筛选出rpoE基因缺失株Tibet-Pm1-ΔrpoE,分析缺失株和原菌株Tibet-Pm1在外界环境生长、环境胁迫存活率、生物被膜形成、细胞黏附性和致病性上的差异。结果表明:利用同源重组技术成功构建出rpoE基因缺失株Tibet-Pm1-ΔrpoE。缺失株的平均OD值为0.135,显著低于Tibet-Pm1菌株的平均OD值0.337(P<0.05)。在20℃条件下,Tibet-Pm1-ΔrpoE菌株生长较缓慢,两种菌株的生长存在明显差异;不同温度下3 h内两种菌株生长的差异性较小。在紫外线照射条件下,Tibet-Pm1-ΔrpoE菌株的存活率由21.3%降到16.7%;在50℃高温条件下,Tibet-Pm1-ΔrpoE菌株的存活率由0.75%降到0.59%。在细胞黏附试验中,Tibet-Pm1-ΔrpoE菌株在MDBK中的黏附性由6.67×10^(5)cfu降到1.20×10^(5)cfu,两种菌株在PK15细胞中的黏附性差异不明显。在11 h内攻毒的家兔全部死亡,但以Tibet-Pm1-ΔrpoE菌株攻毒的家兔平均生存时间长,剖检死亡家兔可见部分器官出现充血或出血现象,盲肠充气。说明rpoE基因是Tibet-Pm1菌株的潜在毒力因子,缺失rpoE基因可抑制Tibet-Pm1菌株生物被膜的形成,影响其抵御外界环境的能力,黏附性下降,致病性降低。

RpoE缺陷对甲型副伤寒沙门氏菌在肉制品加工中热失活特性的影响

目的:RpoE作为由rpoE基因编码的σ因子,是普遍存在于革兰氏阴性细菌中的一类调节基因,对细菌响应各种环境胁迫起着重要的调节作用。为了解甲型副伤寒沙门氏菌rpoE基因在肉制品加工过程中的热应激响应特征。方法:本研究首先对缺陷株△rpoE在最适温度的生长情况进行分析,然后以55,63,72℃对接种10~8CFU/g甲型副伤寒沙门氏菌缺陷株△rpoE和野生株的介质进行热处理,测定处理后样品中甲型副伤寒沙门氏菌的残存数量,比较缺陷株和野生株在肉制品加工中的失活情况。结果:研究结果表明,在最适温度37℃条件下,缺陷株和野生株的生长能力没有显著性差异。野生株和缺陷株在55℃的D值分别为14.0980,10.8933 min,在63℃的D值分别为1.3078,0.3147 min,在72℃的D值分别为0.9885,0.9135 min,并且3个温度下甲型副伤寒沙门氏菌缺陷株和野生株的D值之间有显著性差异(t<0.05),因此野生株的耐热能力显著高于缺陷株。结论:rpoE基因对甲型副伤寒沙门氏菌的耐热性起了重要作用,本文为进一步探讨甲型副伤寒沙门氏菌耐热机理及其控制提供了理论参考。

伤寒沙门菌rpoE基因缺陷变异株的制备及其生存能力

目的为深入研究rpoE基因在伤寒沙门菌侵袭致病中的作用,制备rpoE基因缺陷变异株;观察rpoE基因缺陷变异株在应激条件下的生存能力。方法根据伤寒沙门菌rpoE基因序列,设计PCR特异性引物,制备rpoE基因缺陷性同源性核苷酸片段导入自杀质粒PGMB151后再导入伤寒沙门菌野生株,进行同源重组,用PCR观察重组现象;绘制生长曲线,对比rpoE基因缺陷变异株与野生株在应激条件下的生存情况。结果PCR及序列分析证实,缺陷变异株的rpoE基因缺失288个碱基;生长曲线提示rpoE基因缺陷变异株在氧、酸、高渗应激条件下生存能力明显低于野生株,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建了伤寒沙门菌rpoE基因缺陷株,并发现在氧、酸、高渗应激条件下其生存能力明显降低,为进一步研究其在伤寒沙门菌中的功能奠定了基础。

一株西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌基因分型及rpoE基因生物信息学分析

为分析本实验室分离保存的一株西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌基因型和rpoE基因编码蛋白的生物特性,通过16SrDNA、特异性基因、荚膜分型、脂多糖分型、rpoE基因扩增等分子生物学和生物信息学方法对此株牦牛源多杀性巴氏杆菌进行分析。结果表明:此株牦牛源多杀性巴氏杆菌为B∶L2∶ST44基因型,rpoE基因和印度牛源多杀性巴氏杆菌rpoE基因相似性为100%,分子量22.0ku,理论等电点4.86,属于不稳定、无跨膜结构、无信号肽、有保守结构域和有潜在磷酸化的胞内亲水性蛋白,二级结构α-螺旋占比最高67.02%,三级结构为棒状微弯曲模型,存在多个抗原表位,预测可与10个蛋白存在相互作用。综上,本研究对一株西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌进行基因分型和rpoE基因进行生物信息分析,为进一步了解西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌基因型和探索RpoE蛋白的生物学特性提供数据参考。

rpoE基因对环境胁迫下肠炎沙门氏菌生长能力的影响

rpoE基因是普遍存在于细菌中的一类调节基因,对细菌响应各种环境胁迫起着重要的调节作用。该研究利用λ噬菌体的Red重组系统构建出肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis,S.E)的rpoE基因缺陷株ΔrpoE,并考察ΔrpoE在不同环境胁迫条件下的生长能力。结果显示,在37°C时,ΔrpoE的生长能力无显著变化;而在高低温、酸、氧、高渗培养条件下,ΔrpoE的生长能力显著弱于野生株。该研究首次获得了S.E的基因缺陷株ΔrpoE,并初步探索了rpoE基因在S.E中的功能,有助于进一步研究rpoE基因在大肠杆菌、沙门氏菌等肠杆科细菌在响应环境胁迫过程中表现出的生物学功能。

提高钢绳疲劳寿命研究

分析了影响钢绳疲劳性能的各种因素，从原料、热处理、拉丝、镀层和制绳等方面提出了提高的措施，在实际应用中取得较好效果。

基于转录机器全局扰动筛查迟钝爱德华菌毒力相关基因

目的通过转录机器(RNA聚合酶)σE因子过量表达实现全局转录扰动,筛查迟钝爱德华菌(Edwardsiellatarda,E.tarda)毒力相关基因。方法从E.tarda EIB202中PCR扩增RNA聚合酶σE因子编码基因rpoE,连接到载体pACYC184上,构建rpoE基因过量表达菌株;在克隆rpoE基因时引入突变,使该基因表达失活,构建移码突变失活菌株。感染模式生物斑马鱼,检测各菌株半数致死剂量(LD50),RT-PCR法检测各菌株rpoE及其下游调控基因degP、fkpA、plsB、lpxD、yfiO mRNA的转录水平。结果重组质粒pACYC184-rpoE经双酶切及测序证实构建正确;在102、103、104和105CFU/g注射浓度下,空载体转染菌株和rpoE基因过量表达菌株的毒力差异无统计学意义(P>0.05);与空载体转染菌株相比,rpoE基因过量表达菌株rpoE基因mRNA的转录水平上调9.5倍;与rpoE基因移码突变失活菌株相比,rpoE基因过量表达菌株rpoE基因下游调控基因degP、fkpA、plsB、lpxD、yfiO分别上调6.9、2.64、2.85、2.38、1.34倍。结论成功构建了E.tarda rpoE基因过量表达菌株以及移码突变失活菌株,初步确定degP、fkpA、plsB、lpxD、yfiO 5个基因与E.tarda毒力相关。