丙二酸盐克罗诺杆菌rpoS基因突变株与回补株的构建

丙二酸盐克罗诺杆菌(Cronobacter malonaticus)在面对环境胁迫时,通过自身调节机制适应压力。rpoS基因作为一种稳定期σ因子和压力应答过程中的主要调节因子,在细菌抵抗或耐受环境胁迫压力中发挥重要作用。文章运用red同源重组技术和质粒表达系统,构建C.malonaticus G362的rpoS基因缺失株ΔrpoS和回补菌株ΔrpoS-com,为研究丙二酸盐克罗诺杆菌中rpoS基因的功能提供遗传材料。生长曲线测定结果表明,rpoS基因缺失未对正常培养条件下细菌生长产生显著影响。

鳗弧菌rpoS基因克隆及在大肠杆菌中的表达

鳗弧菌是海水鱼类弧菌病的重要病原,弧菌病的发生及流行与该菌在环境中的生存密切相关。RpoS因子是细菌RNA聚合酶的主要组成部分,能够调控细胞对不良环境的抵抗和适应能力。本文从鳗弧菌W-1基因组DNA扩增1 002 bp的特异性片段,序列分析表明含有完整的rpoS基因阅读框,编码333个氨基酸残基的蛋白质。与其他鳗弧菌菌株的rpoS基因序列相似性为100%,与霍乱弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、溶藻胶弧菌rpoS基因的序列相似性分别为78%,77%,77%,76%,75%,与大肠杆菌的序列相似性为71%。将该基因克隆于表达质粒pET-24d(+),在大肠杆菌中表达,用镍亲和层析柱纯化表达蛋白,SDS-PAGE分析表明纯化的蛋白为单一条带,蛋白分子量约42 kDa,与理论分析值相近。研究结果为探索鳗弧菌对自然环境的适应及疾病发生机制提供了依据。

假结核耶尔森氏菌rpoS基因的抗胁迫功能

为探讨食源性病原微生物假结核耶尔森氏菌的抗逆机制,采用同源重组原理进行双交换以获得rpoS基因突变株。分别在5mmol/L H_2O_2和pH 3.5两种胁迫下测定野生型菌株、rpoS基因突变株和互补菌株的存活率,并以2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)为荧光探针,测定两种胁迫下细菌胞内活性氧水平。结果显示,在5mmol/L H_2O_2和pH3.5胁迫下,假结核耶尔森氏菌rpoS基因突变株存活率明显降低,这种降低能够在互补菌株中得到恢复;突变株中胞内活性氧自由基水平明显高于野生型菌株和互补菌株。说明:rpoS基因具有帮助假结核耶尔森氏菌抗氧化胁迫和酸胁迫的功能,且这一功能的发挥是通过调节胞内活性氧水平实现的。

肠炎沙门氏菌rpoS基因缺陷株的构建及其生长特性观察

目的利用λ-red同源重组系统构建食源性肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis,SE)CICC21482rpoS基因缺陷株SE/⊿rpoS,观察其在胁迫环境中的生长特性,以探讨rpoS基因的生物学作用。方法通过PCR扩增两侧为肠炎沙门氏菌rpoS基因同源臂,中间为卡那霉素抗性基因(kmr)的打靶片段,再电击转入含质粒pkD46的肠炎沙门氏菌中,替换rpoS基因,筛选阳性转化子SE/⊿rpoS并用PCR法验证。结果成功构建了肠炎沙门氏菌rpoS基因缺陷株。在常规LB培养基中37℃培养的缺陷株和野生株生长曲线差异无统计学意义(P>0.05);SE/⊿rpoS菌株在45℃、2%NaCl和pH4.0应激条件下的生存能力较野生株弱(P<0.05)。结论成功构建SE/⊿rpoS基因缺陷株。该基因在肠炎沙门氏菌克服高温、高渗、酸应激时被诱导表达从而发挥作用。此结果为进一步研究rpoS基因在应激过程中的作用机制提供了基础资料。

伤寒沙门菌rpoS基因缺陷变异株的生物学特性研究

目的 研究rpoS基因在应激环境下的生物学作用,为临床预防和治疗伤寒沙门菌感染提供可能的靶基因.方法 利用原核生物基因同源重组技术制备伤寒沙门菌rpoS基因缺陷变异株.绘制生长曲线,对比rpoS基因缺陷变异株与野生株在等渗条件和酸应激（pH 4.2）、高渗应激（NaCl 300 mmoL/L）、胆汁应激（脱氧胆酸钠终浓度为1.5 mmoL/L）及氧应激（1 mmol/L H2O2）条件下的生长能力,采用t检验进行统计学分析.结果 成功制备伤寒沙门菌rpoS基因缺陷变异株.与野生株相比,rpoS基因缺陷变异株在酸应激、高渗应激和氧应激条件下的生存能力明显降低（4 h时的t值分别为12.864、3.594和12.979,14 h时的t值分别为6.497、3.039和10.440,P值均〈0.05或〈0.01）.结论 rpoS基因在伤寒沙门菌克服酸、高渗和氧应激时发挥着重要的作用,可以作为临床预防和治疗沙门菌感染的靶基因.

rpoS基因在肠杆菌CGMCC 5087响应环境胁迫中的功能

【背景】苯乙醇(2-Phenylethanol,2-PE)是一种具有玫瑰香气味的高级香料添加剂,被广泛应用于香水、化妆品、食品和医药等领域。目前,利用工程菌合成苯乙醇有很好的应用前景。我们分离到一株肠杆菌(Enterobacter sp.) CGMCC 5087,其可以通过苯丙酮酸途径合成2-PE。然而该菌的生长受到不同环境因素导致的胁迫,进而影响苯乙醇的产量。RpoS作为一种稳定期σ因子和压力应答过程中的主要调节因子,在细菌抗环境胁迫生长中起重要作用。【目的】阐明肠杆菌CGMCC 5087中rpoS基因在多种环境胁迫中的作用,掌握该菌在不同环境胁迫下的生物学特性。【方法】使用CRISPR基因编辑技术敲除rpoS基因,通过质粒表达系统构建互补菌株,检测rpoS基因缺失株ΔrpoS与野生型WT菌株和互补菌株ΔrpoS(rpoS)在高渗透压、高温、低pH和氧化应激环境下的生长情况,并进行统计学分析。【结果】rpoS基因的缺失显著降低了肠杆菌CGMCC 5087的生长。在5%NaCl和pH 5.0胁迫条件下,rpoS基因的缺失导致肠杆菌CGMCC 5087的耐受性显著降低。在42℃高温条件下,rpoS基因的缺失导致肠杆菌CGMCC 5087在对数期的耐受性显著降低,而在衰退期的耐受性增强。1 mmol/L H2O2氧化胁迫条件下,rpoS基因的缺失导致肠杆菌CGMCC 5087的延滞期延长,而进入稳定期后rpoS基因突变株耐受性较野生型菌株明显增强。【结论】在肠杆菌CGMCC 5087中,RpoS在抵抗多种环境压力中均具有重要作用,而且在菌株不同的生长时期对于环境胁迫的应答也有所不同,为进一步了解肠杆菌CGMCC 5087的生物学特性、掌握RpoS在肠杆菌CGMCC 5087合成苯乙醇过程中的作用机制提供基础。

细菌中RpoS蛋白的表达调控及其功能的研究进展

RpoS蛋白是RNA聚合酶的一种σ因子,能够调控一组特异性基因的表达,因此在细菌中发挥着至关重要的作用。在细菌中,RpoS蛋白的表达受到严格的控制,主要表现在3个水平的调控:转录水平,翻译水平和翻译后水平。环境应力作用通过信号传导进入细菌细胞内,引起一系列微环境的改变,进而引起调控子的变化。通过调控子与RpoS蛋白直接和间接的相互作用,达到控制其水平的目的。另外,由于RpoS蛋白在细菌中有特殊作用,因此RpoS蛋白水平的变化会引起众多基因表达水平的改变,从而引起细菌对不同环境应力应答的变化以及细菌的某些特性的改变,为今后细菌病害的防治提供了新的策略。综述了近年来对RpoS蛋白的表达调控以及在几种常见菌种中功能的研究进展,由于RpoS蛋白的功能的复杂性,仍有大量的未知功能有待进一步鉴定。

绵羊痘病毒RPO30基因的克隆及序列分析

选择羊痘病毒RNA聚合酶RPO30进行分析,为进行RNAi羊痘病毒研究,进行目的基因的初步筛选。PCR扩增RPO30基因,连入pMD18-T simple载体并转化DH5a大肠杆菌。经蓝白斑筛选挑选白斑制备质粒,经双酶切、PCR及测序鉴定。结果成功克隆了RPO30基因,克隆的SSPV RPO30基因ORF为585bp,编码193个氨基酸,阅读框内有一个HindIII酶切位点,测序结果与Gen Bank数据库中不同痘病毒毒株之间同源性存在着明显区别。进一步经过生物学软件分析表明RPO30蛋白质氨基酸4—12、18—26、50—61、68—92,176—190位之间区域形成活性中心的可能性较大,选择这些区域进行作用可能会造成该基因产物酶的失活,从而高效抑制病毒的复制。

基因芯片技术检测结核分支杆菌耐利福平基因突变的研究

目的建立基因芯片检测结核分支杆菌耐利福平基因突变,结合基因测序和常规药物敏感性试验进行比较,探讨其实用价值。方法根据结核菌rpoβ基因突变特点,设计不同的寡核苷酸探针,点样制备可检测rpoβ基因突变的芯片,检测利福平(Rifompicin,RFP)株的rpoβ变异情况。结果137株临床分离结核菌,49株耐RFP,占35.8%,平均MIC为179.6±135.0μg/mL。Rpoβ突变率为95.7%(47/49),主要为点突变。突变点依次为531 Ser(TCG)→Leu(TTG)(40.8%)、531 Ser(TCG)→Trp(TGG)(12.2%)、526 His(CAC)→Tyr(TAC)(6.1%)、526 His(CAC)→Asp(GAC)(6.1%)、526 His(CAC)→Asn(AAC)(6.1%)、526 His(CAC)→Pro(CCC)(8.2%)、516Asp(GAC)→Val(GTC)(12.2%)、533Leu(CTG)→Arg(CGG)(4.1%)和513Gln(CAA)→Pro(CCA)(2.1%)。结论本研究建立的检测结核菌rpoβ基因突变的基因芯片技术敏感性高,特异性强,可应用于结核菌耐RFP基因的检测。

结核分支杆菌利福平和链霉素耐药基因的快速检测

目的 :评估采用聚合酶链反应 -单链构象多态性 (PCR SSCP)同时检测rpsL基因、rpoB基因突变在结核分支杆菌耐链霉素 (SM )和利福平 (RFP)耐药性测定中的应用价值。方法 :采用PCR SSCP技术对 86株结核分支杆菌临床分离株rpsL基因、rpoB基因突变同时进行检测。即首先用PCR方法同时扩增RFP、SM的rpoB基因和rp sL基因 ,然后进行SSCP分析。结果 :以结核分支杆菌H3 7RV为对照 ,41株药物敏感株的rpsL基因、rpoB基因均未见SSCP图谱异常。特异性为 10 0 %。 45株同时耐链霉素和利福平的耐药株中 ,3 4株 (75 6% )有rpsL基因图谱异常 ;41株 (90 1% )有rpoB基因图谱异常。结论 :rpoB基因突变和rpsL基因突变与结核分支杆菌耐利福平和链霉素密切相关 ,应用PCR SSCP技术可同时快速检测结核分支杆菌对链霉素和利福平耐药性。

藻酸盐裂解酶对高黏液性肺炎克雷伯杆菌生物被膜的影响

为了研究藻酸盐裂解酶(AlgL)对高黏液型肺炎克雷伯杆菌(HvKP)生物被膜和细菌因子RpoS基因的影响,从临床送检的痰液样本中分离出30株肺炎克雷伯杆菌(KP)。采用全自动快速微生物质谱检测系统VITEK进行菌种鉴定,通过药敏试验进行耐药分析,拉丝试验阳性的菌株确定为HvKP;采用半定量结晶紫染色法进行细菌生物被膜半定量检测;用聚合酶链反应(PCR)检测RpoS基因的表达情况。试验发现,AlgL对HvKP生物被膜的形成有显著性抑制作用。本研究为AlgL在临床上用于治疗HvKP提供了研究基础。

山羊痘病毒RPO30基因绿色荧光蛋白质粒的构建及融合表达

为了研究针对山羊痘病毒RPO30的siRNAs的干扰效果,构建了RPO30基因与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的融合表达质粒,并在BHK-21细胞中表达。通过对RPO30基因进行PCR扩增,克隆入表达载体pEGFP-N1,并进行双酶切及测序鉴定;将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和RPO30基因的转录水平。结果显示,获得的目的基因片段大小与预期结果相符,该基因与Gen-Bank数据库中RPO30基因序列的同源性为97%。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内绿色荧光蛋白的表达,转染后第48小时,阳性细胞率达到80.1%;经RT-PCR检测,细胞内有RPO30基因的转录。证实,已成功构建了RPO30基因与EGFP基因的融合表达质粒,并在BHK-21细胞中获得了表达。

绵羊痘病毒吉林株的分离鉴定及其RPO30、P32和Kl基因的克隆与进化分析

从病理学和病原学角度对临床一起疑似羊痘病例进行了系统的检测分析,确诊该起病例为绵羊痘病毒（sheep poxvirus,SPPV）感染所致。对病死羊进行大体病理剖检,病羊口腔黏膜、尾根及肺脏等内脏器官表面可见有大量痘疹样结节;病理组织学观察可见,肺脏支气管黏膜上皮细胞、肺泡上皮细胞发生变性、坏死、脱落,并伴有上皮化生;此外,在肺泡上皮细胞胞浆中可见有嗜酸性病毒包涵体,该结果提示这起病例可能是羊痘病毒感染所致。之后从病原学角度进行了检测分析,电镜负染观察可见典型的痘病毒粒子;RPO30、P32、Kl基因的PCR检测结果显示,均扩增出与预期目的片段大小相一致的条带;P32基因的系统发育进化分析结果显示,该分离株与SPPV-AV40的亲缘关系较近,证实了该起病例的病因为SPPV感染所致,命名为SPPV-Jilin分离株（KF991006）。该分离株RPO30和Kl基因的测序分析结果发现,与山羊痘病毒相应序列相比,其RPO30基因缺少21bp的核酸序列,而Kl基因在902～925bp位置处存在缺失,该结果表明RPO30和Kl基因将可能用于绵羊痘病毒与山羊痘病毒的鉴别诊断。

牛结节性皮肤病病毒抗体竞争ELISA检测方法的建立

为建立高效检测牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus, LSDV)的血清学方法,本研究设计优化LSDV RNA聚合酶30亚基(RPO30)蛋白的密码子,构建其原核表达质粒pET-25b-RPO30,并进行诱导表达和阴离子纯化。纯化后的RPO30蛋白可以被LSDV的阳性血清识别,具有良好的反应原性。用纯化的RPO30蛋白免疫BALB/c小鼠,并将免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,筛选到能够稳定分泌抗体且具有竞争效果的杂交瘤细胞株1H1。以重组RPO30蛋白为包被抗原,经反应条件的优化,建立了基于RPO30蛋白的竞争ELISA(cELISA)抗体检测方法。本研究建立的cELISA检测方法的最适抗原包被质量浓度为1 mg/L,用含5%牛血清白蛋白(BSA)的PBST作为封闭液37℃孵育2 h,待测血清的最适稀释度为1∶2,1H1抗体稀释度为1∶2 000,兔抗鼠HRP-IgG稀释度为1∶4 000,最佳显色条件是37℃反应15 min。当检测样品的1-S/P≥0.55,判定结果为阳性;当检测样品的1-S/P<0.55,判定结果为阴性。利用该方法检测了LSDV、牛传染性鼻支气管炎病毒(IBRV)、牛支原体(M.bovis)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛布鲁杆菌(B.abortus)、口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清,结果显示除了LSDV检测结果阳性外,其他病原的检测结果都是阴性,说明本方法特异性强。利用本试验建立的cELISA检测有免疫背景的临床血清200份,结果显示,其可用于临床疫苗免疫效果的评估。本研究基于重组RPO30蛋白建立的cELISA方法操作简单、特异性强、敏感性高、重复性好,为LSDV的检测和预防提供了可靠的技术支持。