苦荞芦丁水解酶序列鉴定及在昆虫系统中的表达

为获得苦荞麦中芦丁水解酶基因(Fagopyrum tartaricum rutin-hydrolyzing enzyme gene,FtRHE),以云荞1号苦荞种子为材料,制备获得天然芦丁水解酶(rutin-hydrolyzing enzyme,RHE),通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定天然RHE序列信息,结合转录组数据,筛选苦荞RHE基因FtRHE。结果显示,纯化的天然RHE,分子质量约为62 kDa,肽质量指纹图谱证明其为一种β-葡萄糖苷酶,质荷比为914.428 6的肽段FSISWSR为其特征肽段。在苦荞种子转录组数据中筛选获得FtRHE基因序列基础上,通过反转录聚合酶链式反应获得了苦荞FtRHE基因。FtRHE开放阅读框由1 539个碱基组成,编码512个氨基酸,1~29位氨基酸为其信号肽。多重序列比对发现RHE与不同物种来源的β-葡萄糖苷酶氨基酸保守性不高,同源性普遍集中在54%~62%之间。构建Bacmid-FtRHE杆粒,转染昆虫细胞Sf9后,成功表达了具有较高活性的重组RHE。结果表明,获得的FtRHE即为苦荞中RHE基因。该研究为高含量芦丁及无苦涩味荞麦育种以及由芦丁生物转化生产槲皮素等的应用提供了理论支持。