人脐带非酶解法培养MSCs的方法建立

目的建立从人脐带Wharton's jelly组织中直接培养间充质干细胞(MSCs)的方法。方法将人脐带切成5 cm左右的片段,纵向剖开,剔除血管,把富含Wharton's jelly组织的脐带面置于10 cm2塑料培养皿的培养面上,加入含20%FBS的LG-DMEM培养基连续培养10 d;移去脐带组织后,培养皿中的细胞继续培养至80%-90%融合。传代和扩增3代(次)后,以倒置光学显微镜观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞免疫表型及细胞周期,用含有成骨细胞诱导剂、脂肪细胞诱导剂对传代培养至第3代的细胞分别定向诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞,并对诱导后细胞用碱性磷酸酶检测试剂、Von-Kossa染色检测试剂和茜苏红染色试剂作细胞生物学检测。结果脐带组织在贴壁培养5 d,组织周围可见有少量细胞贴壁生长,主要呈"成纤维样",形状不规则,移去脐带组织后继续培养至14-15 d时,细胞达到80%-90%汇合;细胞表面表达CD73、CD105、CD90、CD44、CD29、CD71及CD13,不表达CD34、CD14、CD133、CD45、HLA-DR;培养至第4代时约72.724%的细胞处在G1期,S期细胞占18.069%,第6代时,G1期细胞约为83.875%、S期细胞仅为9.606%左右。细胞经成骨细胞诱导分化后,碱性磷酸酶染色显示呈强阳性,茜苏红染色和Von-Kossa染色显示细胞有钙盐沉积并形成钙结节;细胞经成脂细胞诱导分化后,油红O染色呈红色,显示胞浆内有大量甘油三酯的聚集。结论采用非酶解法从人脐带Wharton's jelly中分离及培养扩增的细胞具备MSCs的基本特性,具有分化为成骨细胞和脂肪细胞的能力。

人骨膜源性成骨细胞的体外培养

探索成骨细胞的体外培养方法 ,建立人骨膜源性成骨细胞体外实验模型。方法 :以人髂骨骨膜为材料 ,通过植块培养法进行细胞培养 ,通过形态学观察 ;细胞的碱性磷酸酶 (ALP)染色 ;培养液中骨钙素 (BGP)的放免分析等进行细胞学鉴定。结果 :成骨细胞为成纤维细胞型 ,贴壁生长 ,形态多样化 ,HE染色细胞轮廓清晰 ,核内可见 2 -3个核仁 ;细胞的ALP染色为阳性 ;培养液中可检测出较高浓度的BGP。结论 :可以利用人骨膜为材料进行成骨细胞的体外培养 ,本培养方法 ,简便易行 ,可靠。