抗sAPRIL抗体的制备及细胞增殖抑制功能分析

本研究旨在通过免疫小鼠制备抗人可溶性增殖诱导配体(soluble a proliferation-inducing ligand,sAPRIL)的多抗,检测其对人sAPRIL促细胞增殖活性的抑制作用。以丧失天然生物学活性,但保留良好免疫原性的sAPRIL重组突变体蛋白为免疫原,加上佐剂免疫人化SCID小鼠,6周后取血清,用间接ELISA法测定抗体滴度,Westernblot测定抗体特异性,MTT法检测所获抗血清抑制sAPRIL促Raji和Jurkat细胞增殖的作用。结果表明,免疫小鼠,获得特异性的小鼠抗人sAPRIL抗体,抗血清滴度达到1∶640。功能实验显示,抗sAPRIL血清可明显降低sARPIL刺激Raji和Jurkat细胞增殖的作用(p<0.05)。结论:成功制备了抗人sAPRIL多克隆抗体,该抗体可以在体外抑制sAPRIL促Raji和Jurkat细胞增殖活性。

抗sAPRIL突变体多抗的制备及免疫抑制功能分析

目的制备抗sAPRIL突变体多抗。观察其对sAPRIL促细胞增殖活性的影响。方法采用在sAPRILC端缺失45bp并加入HEL Th表位序列．且已经证实丧失sAPRIL天然活性的重组突变体蛋白，加上佐剂免疫BALB／c小鼠．6周后取血清。间接ELISA测定抗体滴度；Western blot测定抗体特异性；MTT检测所获抗血清抑制sAPRIL促Raji和Jurkat细胞增殖的作用。结果sAPRIL突变体能诱导小鼠产生特异性抗体，抗体具有较好的特异性，滴度达到1：10000～1：100000；抗sAPRIL突变体血清可明显降低sARPIL刺激Raji和Jurkat细胞增殖的吸光度值（P〈0．01）。结论成功获得抗sAPRIL突变体的多克隆抗体，该抗体可以在体外抑制sAPRIL促Raji和Jurkat细胞的增殖活性。

基于增殖诱导配体新型抗肿瘤分子的构建及初步筛选

目的构建针对APRIL的免疫抑制分子,并对其原核表达蛋白进行纯化及活性筛选。方法将可溶性增殖诱导配体(sAPRIL)cDNA进行突变并插入TELTh表位序列,突变体用pQE-80L/DH5α原核表达系统进行表达,表达蛋白经SDS-PAGE鉴定、Ni-NTA亲和层析纯化及Western印迹分析,最后检测纯化蛋白对Raji细胞增殖的影响。结果成功构建并表达了4种sAPRIL突变体:C端引入HELTh表位的sAPRIL突变体(Ⅰ)、N端引入HELTh表位的sAPRIL突变体(Ⅱ)、C端缺失45bp序列并引入HELTh表位的sAPRIL突变体(Ⅲ)、N端缺失45bp序列并引入HELTh表位的sAPRIL突变体(Ⅳ)。SDS-PAGE电泳、Western印迹分析均检测到相应的特异蛋白带。用Ni-NTA系统成功纯化表达的突变体蛋白。细胞试验表明,突变体Ⅰ、Ⅱ纯化蛋白具有明显的促细胞增殖活性,而突变体Ⅲ、Ⅳ纯化蛋白没有促细胞增殖活性。结论在4种sAPRIL突变体中初步筛选到不具有促细胞增殖活性的APRIL免疫抑制分子,为下一步确定该分子的免疫抑制功能奠定了物质基础。

人可溶性增殖诱导配体cDNA突变体的设计与构建

目的 构建6种人可溶性增殖诱导配体(solubleaproliferation inducingligand ,sAPRIL)cDNA突变体。方法 采用PCR将可溶性增殖诱导配体(sAPRIL)cDNA进行突变,并分别在其N端和C端连接TELTh表位序列,插入到pQE80表达载体上,最后转化至DH5α感受态细胞。重组质粒经酶切鉴定后进行测序。结果 经PCR扩增分别得到了对应于6种突变体的sAPRIL序列,酶切和测序证实成功构建了含HELTh表位的sAPRILcDNA突变体表达质粒。结论 成功构建了6种sAPRILcDNA突变体的表达质粒,为进一步进行sAPRIL突变体cDNA的表达和活性鉴定奠定了基础。