洼地绵羊防御素sBD-1基因克隆、序列分析及SYBR Green Ⅰ实时荧光定量检测方法的建立与应用

根据GenBank上登录的绵羊防御素基因序列,经多重比较后,设计1对引物,从洼地绵羊舌上皮组织中扩增到防御素sBD-1基因,克隆到pMD18-T载体中进行测序。结果表明,扩增基因全长215 bp,编码64个氨基酸。基因进化树分析表明,与蒙古绵羊sBD-1基因有较近的亲缘关系,核苷酸同源性为98.5%;而与黄牛的亲缘关系最远,核苷酸同源性84.6%。氨基酸序列分析表明,序列内无信号肽区域,具有3个潜在的抗原表位。以pMD18-T/sBD-1质粒为模板建立了sBD-1基因SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,核酸电泳、扩增动力学曲线、溶解曲线及重复性试验表明,检测方法具有良好的稳定性和特异性,得到的回归方程(R2=0.998)表明PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在良好的线性关系,从舌、盲肠及输卵管等组织中可以进行有效的检测,检测灵敏度为83.9 copies/μL。该方法为进一步研究防御素sBD-1基因在洼地绵羊抗逆性过程中的作用奠定了基础。