sH-2K^d-HBc四聚体的构建及其初步的检测应用

目的:sH-2Kd-HBc复合物四聚体的构建与检测,为进一步检测抗原特异性T细胞,探讨免疫发病机制奠定基础。方法:将四个生物素化的可溶性复合物单体与荧光标记的亲和素结合形成四聚体。采用HBcAg真核表达质粒(pcDNA3-C)通过不同的途径免疫小鼠,获得针对核心抗原的特异性CTL,与制备的四聚体共孵育,结合流式细胞仪术进行检测。结果:三种免疫方法所得到的细胞中,抗原特异性CTL频数较对照组都有明显提高(0.24%,0.26%,0.36%vs 0.07%,P≤0.05)。显示制备的四聚体能与抗原特异性T细胞结合,具有检测功能。三种不同的免疫途径所引起的抗原特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答强度各有不同。与传统的肌肉注射组相比,基因枪免疫组的体液免疫应答水平较弱而细胞免疫应答水平较强。高压水注射(HDI)组的体液免疫应答和细胞免疫应答水平都要明显高于肌肉注射组结论:获得了功能性的sH-2Kd-HBc复合物四聚体,为进一步检测抗原特异性T细胞奠定基础。

sH-2K^d肽复合物的构建及多克隆抗体的制备

目的构建可溶性的H-2Kd肽复合物,并制备抗MHC-Ⅰ(H-2Kd)分子多克隆抗体。方法原核高效表达的sH-2Kd-BSP和β2 m蛋白,在抗原肽(乙型肝炎病毒的核心蛋白HBc131-139)的存在下,体外复性折叠成可溶性的H-2Kd-β2m-抗原肽复合物单体,经BirA酶作用并通过凝胶过滤层析法纯化复合物单体。应用纯化的该复合物单体免疫C57BL/6小鼠制备多克隆抗体。结果①Western blot检测显示获得了生物素化的sH-2Kd-HBc复合物单体。②Western blot检测显示抗MHC-Ⅰ(H-2Kd)分子多克隆抗体与复合物单体有很好的抗原抗体反应;Balb/C小鼠脾脏冰冻切片的免疫组化结果:在细胞膜表面见棕色着色。③Dot-ELISA检测该多克隆抗体的滴度可以达到1∶3 200。结论成功构建了具有完整构象的生物素化sH-2Kd-HBc复合物单体,制备了抗MHC-Ⅰ(H-2Kd)分子多克隆抗体。

H-2K^d四聚体的制备及其在检测特异性同种CTLs中的应用

目的制备H-2Kd限制性胰岛GAD抗原肽/H-2Kd四聚体并用于检测相应的特异性同种CTL。方法以原核表达的sH-2Kd-BSP为重链,β2m为轻链,与人工合成的GAD抗原肽在体外利用稀释法进行共折叠复性得到单体。然后在BirA酶作用下对其进行生物素化,通过凝胶过滤层析法纯化生物素化的复合物单体,再与Strep-tavidin-FITC按4∶1比例混合形成四聚体;取Balb/c小鼠(H-2Kd)巨噬细胞加载胰岛GAD抗原肽,作为刺激细胞,取C3H小鼠脾细胞(H-2KK)作为效应细胞,在体外进行混合淋巴细胞培养,以获得针对H-2Kd限制性胰岛GAD抗原肽的特异性同种CTL。结果该四聚体能够与长期混合淋巴细胞培养出的同种特异性T细胞结合。结论成功构建胰岛GAD抗原肽/H-2Kd四聚体,并可用于针对H-2Kd限制性胰岛GAD抗原肽特异性同种CTL的检测。

生物素化sH-2K^d-HBc复合物单体的构建及纯化

目的构建及纯化生物素化的sH-2Kd-HBc复合物。方法以原核表达的sH-2Kd-BSP为重链,β2m为轻链,分别纯化后与H-2Kd限制性9肽(HBc131~139)在体外采用稀释法进行共折叠复性,然后在B irA酶作用下,对折叠产物进行生物素化,形成了生物素化的H-2Kd-HBc复合物。通过凝胶过滤层析法进一步纯化生物素化的复合物单体。结果原核表达质粒pET-H-2Kd-BSP的测序结果与GenBank所公布的序列一致。利用辣根过氧化物酶标记的亲和素对折叠复性及生物素化后的复合物进行检测,证明成功获得了生物素化的sH-2Kd-HBc复合物。结论获得了纯化的生物素化sH-2Kd-HBc复合物单体,为进一步在体外构建sH-2Kd-抗原肽四聚体及制备人工抗原提呈细胞,深入研究HBV感染过程中特异性CTL应答和效应机制奠定了基础。

新型冠状病毒抗原表位及其特异性T细胞的筛选

该文利用MHC四聚体技术从接种新冠疫苗人群体内筛选出SARS-CoV-2特异性T细胞。该实验针对中国人群最为常见的HLA-A*0201分型,通过IEDB、SYFPEITHI和NetMHCpan4.0等生物信息学方法预测新冠病毒S蛋白抗原肽,并结合UV-置换抗原肽实验验证,确定了7个9肽抗原肽,分别是S538、S976、S996、S1060、S1185、S1192和S1220,其中S1220的亲和性最高,S538的亲和性最低。接着利用MHC四聚体技术合成了除S538外的6种HLA-A*0201限制性S蛋白特异性四聚体,并在接种疫苗的HLA-A*0201人群PBMCs中筛出了其特异性的T细胞。这证明了接种新冠疫苗的HLA-A*0201人群体内的确存在针对SARS-CoV-2的细胞免疫反应,同时发现不同个体对SARS-CoV-2不同抗原肽免疫反应产生的特异性T细胞在数量和频率上存在差异性,为后续研究新冠疫苗引起的细胞免疫作了铺垫。